Regulation of Sox2 and stemness by nicotine and electronic-cigarettes in non-small cell lung cancer

doi:10.1186/s12943-018-0901-2

.2018年10月15日；17(1):149.

doi:10.1186/s12943-018-0901-2。

尼古丁和电子烟对非小细胞肺癌中Sox2和烟干的调节

考特尼·M·沙尔^1 2, 纳姆拉塔·博拉·辛哈尔¹, 杜拉拉伊·莫汉·库马尔¹, Srikumar P Chellappan公司^三

附属公司

¹H.Lee Moffitt癌症中心和研究所肿瘤生物学系，美国佛罗里达州坦帕市USF Magnolia Drive 12902号，邮编33612。
²美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学癌症生物学博士项目。
^三H.Lee Moffitt癌症中心和研究所肿瘤生物学系，美国佛罗里达州坦帕市USF Magnolia Drive 12902号，邮编33612。Srikumar.Chellappan@moffitt.org。

PMID： 30322398
预防性维修识别码： PMC6190543型
内政部： 10.1186/s12943-018-0901-2

尼古丁和电子烟对非小细胞肺癌中Sox2和烟干的调节

考特尼·M·沙尔等。摩尔癌症. 2018.

.2018年10月15日；17(1):149.

doi:10.1186/s12943-018-0901-2。

作者

考特尼·M·沙尔^1 2, Namrata Bora Singhal村¹, 杜拉伊拉伊·莫汉·库马尔¹, Srikumar P Chellappan公司^三

附属公司

¹H.Lee Moffitt癌症中心和研究所肿瘤生物学系，美国佛罗里达州坦帕市USF Magnolia Drive 12902号，邮编33612。
²美国佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学癌症生物学博士项目。
^三H.Lee Moffitt癌症中心和研究所肿瘤生物学系，美国佛罗里达州坦帕市USF Magnolia Drive 12902号，邮编33612。Srikumar.Chellappan@moffitt.org。

PMID： 30322398
预防性维修识别码： PMC6190543型
内政部： 10.1186/s12943-018-0901-2

摘要

背景：肺癌是癌症相关死亡的主要原因，其发病率与吸烟密切相关。尼古丁是烟草烟雾的成瘾成分，不能引发肿瘤，但可以促进体外细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进体内肿瘤的生长和转移。烟碱介导的肿瘤促进是通过激活烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs），特别是α7亚基来实现的。最近，尼古丁被认为与促进肺癌干细胞样侧群细胞的自我更新有关。这种肿瘤干细胞亚群与肿瘤的发生、异质性肿瘤的生成、转移、休眠和耐药性有关。在这里，我们描述了驱动尼古丁和电子烟提取物介导的非小细胞肺癌干细胞自我更新的分子事件。

方法：根据本文描述的方案，使用A549和H1650非小细胞肺癌细胞系和人类间充质干细胞进行了实验。在所有相关实验中使用了2μM尼古丁或电子烟提取物。采用免疫印迹法、瞬时转染法、RT-PCR进行生化分析，采用双重免疫荧光和共焦显微镜进行细胞生物学分析，并进行邻近连接分析。

结果：在此，我们证明尼古丁可以诱导胚胎干细胞因子Sox2的表达，这对于非小细胞肺腺癌（NSCLC）细胞的自我更新和干细胞特性的维持是必不可少的。我们进一步证明，这是通过Src和Yes激酶下游的nAChR-Yap1-E2F1信号轴发生的。我们的数据表明，10月4日也可能在这一过程中发挥作用。在过去几年里，电子烟（电子烟）被推广为传统吸烟的更健康替代品，因为它们不含烟草；然而，它们仍然含有尼古丁。因此，我们研究了电子烟提取物是否能增强与尼古丁类似的促肿瘤特性；我们发现它们可以诱导Sox2和间充质标记物的表达，并增强NSCLC细胞的迁移和干细胞。

结论：我们的发现揭示了癌症干细胞群体背景下吸烟相关肺癌病理生理学的新分子机制，并揭示了可能用于治疗的新途径。

关键词：肿瘤干细胞；电子烟；尼古丁；非小细胞肺癌；Sox2。

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不适用。

出版同意书

不适用。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
一尼古丁和电子烟提取物促进A549细胞干样SP细胞的自我更新；在H1650细胞上也获得了类似的结果(b条). SP代表侧群，MP代表主群细胞。使用siRNA耗尽Sox2可消除A549细胞的SP细胞的自我更新(**c（c）**)或H1650电池(d日). 尼古丁和电子烟提取物诱导A549细胞发生EMT样改变。用ZO1抗体进行的免疫荧光实验表明，尼古丁和电子烟提取物有效地减少了紧密连接（红色荧光）；CRM1和DAPI用于可视化细胞(**e（电子）**). E-cadherin也观察到类似结果(**（f）**).克RT-PCR实验显示间充质标记物波形蛋白和纤维连接蛋白以及ZEB1和ZEB2的诱导作用。这里给出的数据是由三个独立实验得出的±标准偏差（SD）值。两组之间的统计比较采用非配对双尾Student t检验。**h-i型**创伤愈合试验表明，尼古丁和电子烟提取物促进A549细胞在塑料上的迁移(小时)伤口的愈合用图形表示为一段时间内伤口面积的%(我). 两组之间的统计比较采用非配对双尾Student t检验

图2
一免疫荧光实验显示尼古丁和电子烟提取物在A549细胞（上图）和人间充质干细胞（下图）中诱导Sox2。b条.通过western blotting观察到的相同试剂诱导Sox2。**c（c）**RT-PCR实验表明，尼古丁和电子烟提取物在A549细胞的转录水平上诱导了Sox2。d日用烟碱和电子烟提取物瞬时转染Sox2-Luciferase报告子的A549和H1650细胞可诱导启动子活性，证实了在转录水平上诱导Sox2。**e（电子）**显示尼古丁在处理后18小时至48小时诱导Sox2蛋白的蛋白质印迹**（f）**)RT-PCR实验显示在相同时间点诱导Sox2消息。此图中所示的图形数据具有三个独立实验得出的±标准偏差（SD）值。两组之间的统计比较通过非配对双尾Student t检验进行

图3
一siRNA对E2F1、YAP1或α7 nAChR的缺失可阻止烟碱介导的Sox2诱导。10月4日的消耗或TEAD2对诱导没有任何影响。b条显示通过ChIP分析测试的E2F结合位点位置的示意图；每个位点的正向和反向引物的位置用箭头表示。**c（c）**ChIP分析显示E2F1与所有测试的结合位点相关；E2Fs 2和E2Fs 3主要与引物F2和R2的结合位点有关。没有与c-Fos启动子相关的E2F。d日尼古丁刺激诱导E2F1与引物F1R1和F2R2跨越的位点关联；令人惊讶的是，Rb也可以在F1R1位点检测到。**e（电子）**在A549细胞上进行的瞬时转染实验显示E2F家族成员报告的Sox2-Luc诱导。所示数据为三个独立实验得出的±标准偏差（SD）值。统计比较采用非配对双尾Student t检验。**（f）**YAP1和E2F1可以诱导Sox2启动子，并且在瞬时转染实验中表现出加性效应。所示数据为三个独立实验得出的±标准偏差（SD）值。采用单因素方差分析进行统计比较。克免疫荧光实验显示，尼古丁和电子烟提取物诱导A549细胞和人类间充质干细胞中的YAP1水平

图4
一尼古丁和电子烟提取物促进E2F1和YAP1在A549细胞中的共同定位，如双免疫荧光实验和共焦显微镜所示。b条免疫沉淀western blot实验显示A549和H1650细胞中YAP1与E2F1的关联；用E2F1抗体进行免疫沉淀，然后用YAP1抗体进行免疫印迹。**c（c）**反向进行的IP-western印迹实验进一步证实了YAP1与E2F1的相关性，其中YAP1抗体用于IP，然后用E2F1抗体进行western印记。在本实验中，使用带有Rb抗体的IP作为阳性对照。d日近接连接分析显示，经尼古丁或电子烟提取物处理后，A549细胞中YAP1与E2F1的关联增强。24小时时相互作用最大

图5
一用选定的抑制剂治疗可防止尼古丁介导的Sox2诱导；Src家族激酶似乎对诱导尤其重要。b条Src、Yes或β-arrestin-1的耗竭减少烟碱介导的A549细胞中Sox2的诱导(**c（c）**)小干扰RNA对Src的处理降低了YAP1水平及其与E2F1的相互作用；用Src抑制剂处理后也获得了类似的结果(d日).e（电子）近接连接实验表明Src的缺失消除了YAP1与E2F1的相互作用；用Src抑制剂处理后也得到了类似的结果(**（f）**).克IP-western-blot实验表明，Yes和Src的去分泌减少了烟碱介导的YAP1与E2F1的相互作用

图6
一近接连接试验表明，尼古丁可以诱导A549细胞中Oct4与YAP1的结合。b条Oct4、E2F1或YAP1的耗竭可阻止烟碱介导的A549和H1650细胞中Sox2-Luc的诱导。**c（c）**类似地，突变Sox2启动子上的Oct4或E2F结合位点可以阻止尼古丁在A549细胞中诱导其表达，如瞬时转染实验所示。d日突变Oct4结合位点可阻止Oct4诱导Sox2-Luc，但启动子对E2F1有反应；相反，E2F结合位点1或位点2的突变阻止了E2F1对Sox2-Luc报告子的诱导，但在瞬时转染实验中保留了对Oct4的反应。此图中所示的图形数据具有三个独立实验得出的±标准偏差（SD）值。通过单因素方差分析对代表组之间进行统计比较，以确定统计显著性。**e（电子）**尼古丁介导的Sox2上调示意图。尼古丁与α7 nAChR受体结合并以βArr1依赖性方式激活Src，从而促进与Oct4和E2F1的结合，导致Sox2的诱导

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1. Torre LA、Siegel RL、Jemal A.肺癌统计。高级实验医学生物。2016;893:1–19. doi:10.1007/978-3-319-24223-1_1。-内政部-公共医学
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1. Dasgupta P、Rizwani W、Pillai S、Kinkade R、Kovacs M、Rastogi S、Banerjee S、Carless M、Kim E、Coppola D等。尼古丁在多种人类肿瘤细胞系中诱导细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化。国际癌症杂志。2009;124:36–45。doi:10.1002/ijc.23894。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Heeschen C、Jang JJ、Weis M、Pathak A、Kaji S、Hu RS、Tsao PS、Johnson FL、Cooke JP。尼古丁刺激血管生成，促进肿瘤生长和动脉粥样硬化。《国家医学》，2001年；7:833–839. doi:10.1038/89961。-内政部-公共医学

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[10] Heeschen C、Jang JJ、Weis M、Pathak A、Kaji S、Hu RS、Tsao PS、Johnson FL、Cooke JP。尼古丁刺激血管生成，促进肿瘤生长和动脉粥样硬化。《国家医学》，2001年；7:833–839. doi:10.1038/89961。-内政部-公共医学

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