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.2018年12月3日；217（12）：4106-4123。
doi:10.1083/jcb.201804018。 Epub 2018年10月11日。

PP2A-B55促进有丝分裂后核膜的重组果蝇属

海瑟姆·梅森 1, 文森特·布德罗 1 2, 达米安·加里多 1, 穆罕默德·布鲁 三, Myreille Larouche公司 1 2, 保罗·S·马多克斯 1, 安德鲁·斯万 三, 文森特·阿尔坎鲍尔 4 2
附属公司

PP2A-B55促进细胞有丝分裂后核膜重构果蝇属

海瑟姆·梅森等。 J细胞生物学. .

摘要

当分裂细胞退出有丝分裂，子细胞进入间期时，许多蛋白质必须去磷酸化。蛋白磷酸酶2A（PP2A）及其B55调节亚单位在这一转变中起着关键作用，但其底物的特性及其去磷酸化如何促进有丝分裂的退出尚不清楚。我们在年进行了母体效应筛查黑腹果蝇鉴定在细胞周期中与PP2A-B55/Tws起作用的基因。我们发现，Tws和核膜（NE）成分水平降低的卵子通常无法发育，伴随着减数分裂和合胞体有丝分裂后的NE缺陷。我们的机械研究使用果蝇属细胞表明，PP2A-Tws通过去磷酸化BAF促进有丝分裂退出过程中的核膜重组（NE），并表明PP2A-Tws靶向额外的NE成分，包括Lamin和Nup107。这项工作建立了果蝇属作为进一步剖析NER分子机制的有力模型，并提示PP2A-Tws在完成减数分裂和有丝分裂中的其他作用。

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数字

图1。
图1。
PP2A-Tws交互者的母体效应第二站点未完成屏幕。（A）卵中减数分裂的完成和早期胚胎发生果蝇属依赖于母体提供的mRNA和蛋白质。（B）屏幕的设计。基因缺失（缺陷[英国国防部])与突变的等位基因结合tws公司(tws公司P（P）)或mts公司(mts公司XE-2258型)在一个十字架上。两者的杂合性tws公司P（P）（或mts公司XE-2258型)或英国国防部（或突变）允许存活和生育，但两者的杂合性导致雌性卵无法孵化。（C）该筛查中确定的基因可能在细胞周期中作用于（X）上游、（Y）下游或与（Z）PP2A-Tws平行。（D）主要结果概述。被发现与基因相互作用的特定基因的名称tws公司和mts公司在与发现的缺陷相对应的数据点上显示。
图2。
图2。
PP2A-Tws和Lamin之间的协作是合胞体胚胎发育所必需的。（A）不同等位基因之间的遗传相互作用tws公司和兰姆对所示基因型雌性胚胎的孵化率进行评分。误差条代表SEM。***，P<0.0001，双尾t吨测试。（B）胚胎的蛋白质印迹显示蛋白质水平如何受到母体基因型的影响。（C）通过对α-管蛋白（绿色）、γ-管蛋白和层粘连蛋白（红色）以及DNA（DAPI，蓝色）的免疫荧光显示胚胎中的表型。在胚胎中兰姆K2（K2）/+; tws公司P（P）/+雌性，观察到几个缺陷：异常核分布（左）、形态和大小异常的间期核、中心体分离（黄色箭头）和断裂核（红色箭头）。比例尺，20µm。（D）所示基因型胚胎在不同细胞周期阶段观察到的游离中心体的定量。（E）所示基因型全球胚胎发育的量化。误差条代表SEM.*，P=0.0165；**，0.0021<P<0.0027；***，P<0.0001，双尾t吨测试。
图3。
图3。
PP2A-Tws和Lamin在减数分裂中协同进行NER。收集鸡蛋0到20分钟，在甲醇中固定，并对α-管蛋白（蓝色）、DNA（绿色）和拉明（红色）进行染色。（A–D）来自的代表性图像兰姆K2（K2）/+或tws公司P（P）/+鸡蛋。（A）减数分裂后期纺锤体II。（B和C）减数分裂后间期；图中显示了三个核，每个核周围都有NE。（D）减数分裂完成后形成极体。（东-西）来自的代表性图像兰姆K2（K2）/+；tws公司P（P）/+双份鸡蛋。（E）减数分裂后期正常纺锤体II。（F和G）几个兰姆K2（K2）/+；tws公司P（P）/+减数分裂后间期的卵子要么有三个细胞核带有微弱且不规则的NE（与B和C相比，为F），要么三个细胞核没有NE（G）。（H）大多数鸡蛋来自兰姆K2（K2）/+；tws公司P（P）/+母亲能够正常完成减数分裂，这表现为极体的形成。（一）鸡蛋来自兰姆K2（K2）/+；tws公司P（P）/+母亲完成减数分裂。观察到的表型分为减数分裂、减数分裂后间期（PMI）或完全减数分裂（以极体的形成为标志）。（J）用可检测的NE定量分析减数分裂后间期卵子的比例。对于I和J中的数据，数据来自两个单独的染色和打分，这两个染色和打评分是在多次收集后立即固定的鸡蛋进行的。比例尺，5µm。
图4。
图4。
拉明CDK磷酸化共识位点的磷酸化可能促进其在有丝分裂中的分散。（A）所有七个最小的CDK磷酸化共识位点，如Lamin结构示意图所示（Lyakhovetsky和Gruenbaum，2014），都突变为Ala或Asp残基。星号（*）表示实验中观察到的磷酸化位点（Machowska等人，2015）。（B）表达RFP-Lamin的细胞重量或RFP-Lamin第7章在旋转圆盘共焦显微镜上拍摄。T型0被定义为细胞分裂时伸长的开始。而RFP Lamin重量在有丝分裂过程中变得分散，并在6分钟时开始被招募（箭头所示），RFP-Lamin第7章在细胞进行有丝分裂过程中从不分散。比例尺，5μm。（C）所有CDK共识位点突变为Lamin中的Asp（Myc-Lamin第7天)增加了其溶解度。表达所示蛋白质的稳定细胞系在裂解前按所示进行处理，并将不溶性物质制成颗粒（见材料和方法）。通过Western blot分析组分。（D）来自三个独立实验的可溶和不可溶部分的相对Western blot信号的量化，如B.误差条代表SD.*，P=0.0437，双尾t吨测试。（E）引入一个空等位基因CycB（循环B）(CycB（循环B）2)英寸林K2（K2）/+; tws公司P（P）/+女性拯救她们所生产的胚胎的发育。对所示基因型雌性胚胎的孵化率进行评分。误差条代表SD。**，0.0051<P<0.0095，双尾t吨测试。
图5。
图5。
PP2A-Tws用于在有丝分裂退出期间及时招募Lamin和Nup107以重新组装细胞核。（A）Western blots显示Tws的RNAi缺失。（B和D）表达GFP-Lamin（B）或GFP-Nup107（D）和mCherry-Tubulin的细胞在转染抗Tws或细菌KAN基因的dsRNA后进行实时成像（非靶控）。红色框和黄色箭头表示GFP-Lamin或Nup107-GFP开始重新聚集细胞核。比例尺，5μm。（C和E）定量B和D实验中重组核的GFP-Lamin或GFP-Nup107募集。定量每个时间点重组核固定大小区域的荧光强度。在每种情况下，对29到45个细胞进行定量。阴影区域表示SD。P值来自双尾t吨测试。
图6。
图6。
PP2A-Tws是在有丝分裂退出期间及时募集BAF以重组细胞核所必需的。（A）在用针对Tws或细菌KAN基因的dsRNA转染后（非靶向对照），对表达GFP-BAF和mCherry-Tubulin的细胞进行实时成像。红色框和黄色箭头表示GFP-BAF招募开始。比例尺，5μm。（B）定量A实验中重组核的GFP-BAF募集。定量每个时间点重组核固定大小区域的荧光强度。对于RNAi KAN和RNAi Tws，分别量化了26和25个细胞。阴影区域表示标准偏差。P值来自双尾t吨测试。
图7。
图7。
BAF和层粘连蛋白向重组细胞核的募集依赖于BAF去磷酸化。（A和C）表达RFP-Lamin和GFP-BAF细胞的实时成像重量（A） 或GFP-BAF3A级（C） 用dsRNA转染Tws或细菌KAN基因（非靶控）后进行。红色框和黄色箭头表示RFP-拉明开始向分离的染色体募集。白色箭头表示BAF重量招聘。比例尺，5μm。（B和D）A和C实验中RFP-层蛋白募集的量化。在每个时间点对重组核的固定大小区域的荧光强度进行量化。在每种情况下，对20到35个细胞进行定量。阴影区域表示SD。（E）引进一个突变等位基因nhk-1型在里面兰姆K2（K2）/+; tws公司P（P）/+女性拯救她们所生产的胚胎的发育。对所示基因型雌性胚胎的孵化率进行评分。误差线代表SD.**，P=0.0012；***，P<0.0001双尾t吨测试。
图8。
图8。
BAF和Lamin之间的联系由有丝分裂激酶和磷酸酶调节。（A）如图所示，将稳定表达GFP-BAF和Myc-Lamin的细胞进行不同处理，然后进行针对GFP和Western blots的免疫沉淀（IP）。共免疫沉淀的Myc-Lamin和GFP-BAF之间的比率（三个实验之间的平均值）如下所示。误差条代表SEM。（B）通过转染稳定表达NHK-1-PrA的细胞并进行Western blot，验证了dsRNA对NHK-1的有效性。（C）BAF-层蛋白结合的破坏需要BAF中的NHK-1磷酸化位点（实验如A所示）。
图9。
图9。
Tws在有丝分裂退出期间与BAF相关，PP2A-Tws使BAF去磷酸化。（A）解放军。左图：用Myc-Tws和GFP-BAF转染的细胞使用针对Myc和GFP的抗体（红色病灶）提交给PLA。Myc的免疫荧光平行进行，DNA用DAPI染色。右图：量化每个细胞的PLA病灶。分析仅表达Myc-Tws或GFP-BAF的细胞作为对照。误差线代表SEM。*，P=0.0488；**，P=0.0082；***，P=0.0002，双尾t吨测试。比例尺，5μm。（B）PP2A-Tws在体外脱磷酸BAF肽。对Flag-Tws、Flag-Wdb或Flag-GFP进行免疫沉淀，并与指示的磷酸肽孵育不同时间。左图：按照材料和方法中的描述测量磷酸盐释放。误差条代表SD。右：免疫沉淀产物通过Western blotting进行分析。Mts带强度的相对定量显示在印迹下方。所有显示的结果都是在同一（代表性）实验中获得的。误差条表示三倍的SD。（C和D）转染有指示蛋白的细胞进行GFP联合免疫沉淀，然后进行Western blot分析。星号表示免疫沉淀产物中的背景带（可能对应于IgG重链的二聚体）。
图10。
图10。
PP2A-Tws在有丝分裂后促进NER作用的模型。随着细胞进入有丝分裂，细胞周期蛋白B-CDK1磷酸化层粘连蛋白（红色）和可能的其他蛋白质，包括Nup107（Nups为黄色），以诱导NEB.NHK-1磷酸化BAF（蓝色），诱导其与染色质分离。当细胞退出有丝分裂时，PP2A-Tws使BAF去磷酸化，诱导其在后期快速募集到浓缩染色质（绿色表示PP2A-Tws激活）。Lamin和Nup107也可能被PP2A-Tws去磷酸化，以促进其在NE中的组装。当NE被改造时，BAF被限制在细胞核的内周。
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