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.2018年11月；10（11）：e8799。
doi:10.15252/emmm.201708799。

雷帕霉素通过协同激活自噬和溶酶体生物发生拯救线粒体肌病

加布里埃尔·西维莱托 1, Sukru Anil多根 1, 拉斐尔·塞鲁蒂 1, 法吉奥拉里（Gigliola Fagiolari） 2, 毛里齐奥·莫乔 2, 科斯坦扎·兰佩蒂 三, 克里斯蒂安·贝尼卡 1, 卡洛·维斯科米 4, 马西莫·泽维亚尼 4
附属公司

雷帕霉素通过协同激活自噬和溶酶体生物发生拯救线粒体肌病

加布里埃尔·奇维莱托等。 EMBO分子医学. 2018年11月.

摘要

mTOR抑制剂雷帕霉素通过一种不明确的机制改善了小鼠、蠕虫和线粒体疾病细胞模型的临床和生化表型。在这里，我们发现长期雷帕霉素治疗可以提高运动耐力，纠正肌肉形态异常，并增加肌肉特异性细胞色素c氧化酶（COX）活性Cox15公司击倒老鼠(Cox15型平方米/平方米). 雷帕霉素治疗恢复了自噬流量，幼年时自噬通量受损Cox15公司平方米/平方米肌肉，减少未经治疗的线粒体的数量Cox15公司平方米/平方米老鼠。相反，rilmenidine是一种mTORC1诱导的依赖性自噬诱导剂，对Cox15公司平方米/平方米动物。这种明显的差异支持雷帕霉素抑制mTORC1在改善线粒体功能中起关键作用的观点Cox15型平方米/平方米肌肉。与利美尼丁相比，雷帕霉素治疗还激活了肌肉中溶酶体的生物生成。这种效应与TFEB的核定位增加有关，TFEB是溶酶体生物发生的主要调节因子，受mTORC1依赖性磷酸化的抑制。我们认为自噬通量和溶酶体生物发生的协同激活有助于雷帕霉素有效清除功能失调的线粒体。

关键词：自噬；溶酶体生物发生；mTORC1；线粒体疾病；雷帕霉素。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。雷帕霉素治疗可改善Cox15公司 平方米/平方米老鼠
  1. A类

    跑步机分析(n个=8/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表未配对双尾学生的显著性水平t吨‐测试：***P（P）=0.005（第2周）***P（P）=0.0007（第3周）；和****P（P）<0.0001（第4周）。仅限P（P）雷帕霉素治疗与未治疗的值Cox15型 平方米/平方米展示的是老鼠。

  2. B

    雷帕霉素治疗前后骨骼肌的组织学和组织化学特征Cox15公司 平方米/平方米和重量老鼠。H&E：苏木精和曙红；PAS：周期酸–希夫反应；COX：细胞色素c氧化酶；SDH：琥珀酸脱氢酶。比例尺对应50μm。

  3. C类

    不同基因型肌纤维横截面积的分析(n个=3/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：***P（P） = 0.001; ***P（P） = 0.006; 和****P（P）<0.0001。

  4. D类

    肌纤维中央核数的分析(n个=3/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：**P（P） = 0.0018 (Cox15公司 平方米/平方米相对于WT）**P（P） = 0.0052 (Cox15公司 平方米/平方米雷帕霉素与Cox15公司 平方米/平方米).

  5. E类

    肌肉纤维中PAS反应强度的分析(n个=4/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：*P（P）=0.0293（重量与Cox15公司 平方米/平方米)和*P（P） = 0.0150 (Cox15公司 平方米/平方米与Cox15型 平方米/平方米+雷帕霉素）。

  6. F类

    肌肉纤维中COX反应强度的分析(n个 = 3). 黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：****P（P） < 0.0001; **P（P） = 0.0031.

  7. G公司

    肌肉纤维中SDH反应强度的分析(n个 = 3). 黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米误差条代表SEM。星号代表通过单向方差分析和Tukey的事后多重比较测试计算的显著性水平：*P（P） = 0.0199, **P（P） = 0.0091.

图2
图2。雷帕霉素改善Cox15公司 平方米/平方米骨骼肌
  1. A类

    呼吸链的分光光度活性(n个=4-5/组）。CS：柠檬酸合酶；cIV：复合物IV。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表通过双向方差分析和Tukey修正计算的显著性水平：****P（P）<0.0001（CS:WT与Cox15公司 平方米/平方米), ***P（P）=0.0010（碳钢：Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米雷帕霉素）***P（P）=0.005（cIV：Cox15公司 平方米/平方米与WT相比）****P（P）<0.0001（cIV/CS:WT与Cox15公司 平方米/平方米)**P（P）=0.0060（cIV/CS：Cox15公司 平方米/平方米雷帕霉素与Cox15公司 平方米/平方米).

  2. B

    呼吸复合物亚单位的免疫印迹显示。请注意Cox15公司 平方米/平方米与重量样品，经雷帕霉素处理后降至正常水平。在单独的凝胶上运行其他样品（未显示）。

  3. C类

    cIV的BNGE凝胶内活性。Sc：超复杂。注意，雷帕霉素治疗组与未治疗组相比，COX反应略有增加Cox15公司 平方米/平方米样品。

  4. D类

    使用抗cIV抗体（COX1）对1D‐BNGE进行免疫印迹。注意，雷帕霉素治疗组与未治疗组相比，COX含量略有增加Cox15公司 平方米/平方米肌肉。SDHB被用作负荷控制。

  5. E类

    状态III（琥珀酸盐驱动）耗氧量(n个=3/组）。误差条代表SEM。星号代表未配对双尾学生的显著性水平t吨‐测试：**P（P）=0.0016（重量与Cox15公司 平方米/平方米); *P（P） = 0.047 (Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米+雷帕霉素）。

  6. F类

    线粒体DNA数量分析(n个=9/组）。误差条代表SEM。星号代表用Tukey修正的单向方差分析计算的显著性水平：**P（P） = 0.0020; *P（P） = 0.0296.

图3
图3。雷帕霉素改善小鼠线粒体超微结构Cox15公司 平方米/平方米老鼠
请注意，线粒体在Cox15公司 平方米/平方米肌肉（白色箭头），可能是内溶酶体内细胞器部分消化的结果。黑色箭头表示正常线粒体的例子Cox15公司 平方米/平方米这些结构中只有少数存在，也可以在雷帕霉素治疗的动物中检测到重量样品。比例尺对应1136 nm（4400×）。
图4
图4。雷帕霉素诱导自噬Cox15公司 平方米/平方米肌肉
  1. A类

    骨骼肌稳态自噬标记物的代表性Western blot。GAPDH被用作负荷控制。

  2. B

    免疫印迹的密度分析类似于（A）(n个=4/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米误差条代表SEM。星号代表通过单向方差分析和Tukey的事后多重比较测试计算的显著性水平：**P（P）=0.0068（LC3‐II重量与Cox15公司 平方米/平方米), **P（P）=0.0063（P62重量与Cox15公司 平方米/平方米), *P（P）=0.025（第62页Cox15公司 平方米/平方米与Cox15型 平方米/平方米+雷帕霉素）**P（P）=0.0098（S6重量与Cox15公司 平方米/平方米), *P（P）=0.034（P‐S6重量vs.重量+雷帕霉素）***P（P）=0.0002（P‐S6Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米+雷帕霉素）*P（P）=0.014（P‐S6/S6重量vs.重量+雷帕霉素）***P（P）=0.0007（P‐S6/S6Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米+雷帕霉素）。

  3. C类

    自噬通量分析(n个=3/组）。上面板：具有代表性的Western blotCox15公司 平方米/平方米用秋水仙碱、雷帕霉素或雷帕霉素加秋水仙素治疗WT肌肉。请注意，LC3‐II在Cox15公司 平方米/平方米与重量样品。秋水仙碱没有增加LC3‐II水平，表明自噬流量受阻；雷帕霉素加秋水仙碱处理Cox15公司 平方米/平方米小鼠的LC3‐II水平较高，表明雷帕霉素增加了小鼠的自噬流量Cox15公司 平方米/平方米肌肉。黑色：WT；深灰色：秋水仙碱处理的WT；中灰色：雷帕霉素处理的WT；浅灰色：秋水仙碱加雷帕霉素治疗的小鼠；红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 橙色：秋水仙碱处理；蓝色：雷帕霉素处理Cox15公司 平方米/平方米; 紫色：秋水仙素加雷帕霉素处理Cox15公司 平方米/平方米误差条代表SEM。星号代表通过单向方差分析和Tukey的事后多重比较测试计算的显著性水平：**P（P）=0.0049（重量对重量+秋水仙碱）**P（P）=0.0046（WT+雷帕霉素vs WT+雷帕霉素+秋水仙碱）*P（P）=0.0225（重量与Cox15公司 平方米/平方米)**P（P） = 0.0057 (Cox15公司 平方米/平方米秋水仙碱与Cox15公司 平方米/平方米+雷帕霉素+秋水仙碱）***P（P） = 0.0003 (Cox15公司 平方米/平方米雷帕霉素与Cox15公司 平方米/平方米+雷帕霉素+秋水仙碱）。

图5
图5。利美尼定诱导自噬流量，但不改善Cox15公司 平方米/平方米老鼠
  1. A类

    自噬通量分析(n个=4/组）。上面板：具有代表性的Western blotCox15公司 平方米/平方米和重量用秋水仙碱、利美尼定或利美尼丁加秋水仙素治疗的肌肉。秋水仙碱单独增加LC3‐II重量但不是Cox15型 平方米/平方米老鼠；利美尼定对WT LC3‐II水平没有影响，但在Cox15公司 平方米/平方米老鼠。利美尼定和秋水仙碱增加了两种药物的LC3‐II水平重量和Cox15公司 平方米/平方米老鼠。黑色：WT；深灰色：秋水仙碱处理WT；中灰色：雷帕霉素处理的WT；浅灰色：秋水仙素加雷帕霉素治疗小鼠；红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 橙色：秋水仙碱处理；蓝色：雷帕霉素处理Cox15公司 平方米/平方米; 紫色：秋水仙素加雷帕霉素处理Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：*P（P）=0.012（WT对WT+秋水仙碱）**P（P）=0.0093（（WT+利美尼定vs WT+利美尼定+秋水仙碱）***P（P）=0.0001（重量与Cox15公司 平方米/平方米)**P（P）= 0.0083 (Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米+利美啶）*P（P）= 0.0112 (Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米+利美尼丁+秋水仙碱）****P（P） < 0.0001 (Cox15公司 平方米/平方米+利美尼丁与Cox15公司 平方米/平方米+利美尼丁+秋水仙碱。

  2. B

    跑步机分析(n个=4/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：利美尼定‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：利美尼定‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。

  3. C类

    利美尼定治疗前后骨骼肌的组织学和组织化学特征Cox15公司 平方米/平方米和重量老鼠。H&E：苏木精和曙红；GT:Gomori三色；PAS：周期酸–希夫反应。比例尺对应50μm。

  4. D类

    不同基因型肌肉纤维横截面积的分析(n个=3/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：利美尼定‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：利美尼定‐治疗Cox15型 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：***P（P） = 0.0002, ****P（P） < 0.0001.

  5. E类

    肌纤维中央核数的分析(n个=3/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：利美尼定‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：利美尼定‐治疗Cox15公司 平方米/平方米误差条代表SEM。星号代表通过单向方差分析和Tukey的事后多重比较测试计算的显著性水平：**P（P） = 0.0091.

图6
图6。雷帕霉素（而非利美尼定）诱导TFEB向细胞核移位
  1. A类

    雷帕霉素和利美尼定处理的WT和Cox15公司 平方米/平方米肌肉与未经处理（UT）的样本。CD11C（蓝色信号）表示炎症细胞。比例尺对应30μm。

  2. B

    TFEB阳性核的定量(n个=3/组）。使用伊玛瑞斯斑点表面（不包括CD11C阳性细胞核）进行定量。误差条代表SEM。星号代表通过单向方差分析和Tukey的事后多重比较测试计算的显著性水平：*P（P）=0.0199（重量对重量+雷帕霉素）*P（P） = 0.0150 (Cox15公司 平方米/平方米与Cox15公司 平方米/平方米+雷帕霉素）***P（P） = 0.0001.

图7
图7。雷帕霉素（而非利美尼丁）增加溶酶体的生物生成
  1. A类

    实时PCR分析指示灯1成绩单(n个=3/组）。黑色：未经处理重量; 灰色：雷帕霉素‐治疗重量; 红色：未经处理Cox15公司 平方米/平方米; 蓝色：雷帕霉素‐治疗Cox15公司 平方米/平方米。误差条代表SEM。星号代表学生t吨‐测试：**P（P） = 0.008, *P（P） = 0.038.

  2. B

    雷帕霉素和利美尼丁处理后的抗LAMP1染色重量和Cox15公司 平方米/平方米肌肉与未经处理（UT）的样本。雷帕霉素（而非利美尼丁）增加了LAMP1阳性小泡的数量Cox15公司 平方米/平方米样品（插图）。比例尺对应30μm。

  3. C类

    LAMP1阳性囊泡的定量(n个=3/组）。误差条代表SEM。星号代表使用Tukey的事后多重比较测试通过单向方差分析计算的显著性水平：****P（P）<0.0001。

  4. D类

    组织蛋白酶L比活性(n个=3/组）。误差条代表SEM。星号代表Student’s计算的显著性水平t吨‐测试：*P（P） = 0.0133.

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