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.2018年10月8日;9(1):4139.
doi:10.1038/s41467-018-0656-9。

DNA损伤后ATR/Chk1信号通过sumoylated RhoB介导TSC2溶酶体易位诱导自噬

附属公司

DNA损伤后ATR/Chk1信号通过sumoylated RhoB介导TSC2溶酶体易位诱导自噬

刘明东等。 国家通讯社. .

摘要

DNA损伤可诱导自噬;然而,其潜在机制在很大程度上仍不得而知。在这里,我们报告了DNA损伤通过ATR/Chk1/RhoB介导的TSC复合物溶酶体募集和随后的mTORC1抑制导致自噬。紫外线(UV)或烷基化剂甲基磺酸甲酯(MMS)引起的DNA损伤导致Chk1磷酸化小GTPase RhoB。RhoB的磷酸化增强了其与TSC2的相互作用,并通过PIAS1促进其sumoylation,这是RhoB/TSC复合物转位到溶酶体所必需的。因此,mTORC1被抑制,自噬被激活。RhoB基因敲除严重减弱TSC复合体的溶酶体易位和DNA损伤诱导的自噬。将野生型但不抗sumoylation的RhoB重新导入RhoB-/-细胞恢复自噬的开始。因此,我们的研究确定了TSC复合物易位到溶酶体以响应DNA损伤的分子机制,这取决于ATR/Chk1介导的RhoB磷酸化和sumoylation。

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数字

图1
图1
RhoB由PIAS1汇总。RhoB与Ubc9相互作用。转染有标记Ubc9(F-Ubc9)和HA-标记RhoB(HA-RhoB)指示组合的HEK293T细胞,进行抗标记免疫沉淀(IP),然后进行免疫印迹分析以检测相关RhoB。b条RhoB被合成。将转染有His-tagged RhoB(His-RhoB)、HA-taged SUMO(HA-SUMO)1或2和Myc-tagged Ubc9(Myc-Ubc9)指示组合的HEK293T与6盐酸胍,然后进行Ni-NTA琼脂糖珠下拉(Ni下拉)分析。用抗HA免疫印迹法检测SUMO结合的RhoB。单SUMO和多SUMO到RhoB的共轭表示为RhoB-SUMO与RhoB-(SUMO)n个分别是。c(c)PIAS1促进RhoB的合成。HEK293T细胞与His-RhoB、HA-SUMO2共转染,表明Myc-tagged PIAS(Myc-PIAS)家族成员1-4接受了sumoylation试验,如面板所述b条.d日PIAS1的敲除减弱RhoB的sumoylation。将转染有His-RhoB、HA-SUMO2和shRNAs抗PIAS1指示组合的HEK293T细胞进行sumoylation试验,如面板所述b条.e(电子)PIAS1介导的RhoB sumoylation需要E3催化活性。如图所示,用His-RoB、HA-SUMO2和Myc-PIAS1野生型(WT)或催化失活突变体(C351S)转染HEK293T细胞。按照面板中的描述,对细胞进行sumoylation分析b条.(f)PIAS1与内源性RhoB相互作用。用编码HA标记的PIAS1-C351S突变体(HA-PIAS1-C351S)的慢病毒转导的HeLa细胞进行抗RhoB IP,然后用大鼠抗HA进行免疫印迹,以检测相关的HA-PIAS-C351S。RhoB上的酰化位点定位。转染HA-SUMO2的HEK293T细胞表明His-RhoB突变体接受了面板中所述的sumoylation试验b条.小时PIAS1增强WT的sumoylation,但不增强4KR RhoB。将转染HA-SUMO2、Myc-PIAS1(WT或C351S)和His-RhoB(WT or 4KR)指定组合的HEK293T细胞进行sumoylation分析,如面板所述b条
图2
图2
Sumoylated RhoB转位到溶酶体。RhoB的氨甲酰化反应对紫外线(UV)或甲基磺酸甲酯(MMS)处理具有特异性。紫外线处理后1小时(80 Jm−2)或2MMS处理后h(0.5mM),喜树碱(CPT)(10μM)或阿霉素(DOX)(0.5μM)、表达HA-SUMO2和His-RhoB的HEK293T细胞进行sumoylation分析以检测RhoB SUMO2结合。b条紫外线或MMS处理增强内源性RhoB的酰化。对表达His-SUMO2的HeLa细胞进行sumoylation试验2紫外线处理后h(80 Jm−2)或4MMS处理后h(0.5mM)。用RhoB抗体免疫印迹法检测RhoB的SUMO2结合。c(c)紫外线或MMS治疗后,内源性RhoB与LAMP1共定位,但不与CPT或DOX治疗共定位。HeLa细胞接受免疫荧光分析2经过或不经过紫外线处理后h(80 Jm−2)、彩信(0.5mM),锥体贯入度试验(10μM)或DOX(0.5μM)。比例尺,10微米。d日紫外线或MMS处理后,RhoB WT而非RhoB-4KR与LAMP1共定位。对表达HA-RhoB(WT或4KR)的U2OS细胞进行免疫荧光分析4紫外线照射后h(80 Jm−2)或彩信(0.5mM)处理以检查HA-RhoB和内源性LAMP1的定位。比例尺,10微米
图3
图3
紫外线或MMS诱导的自噬需要Sumoylated RhoB。淘汰RhoB(节奏B)减少UV或MMS处理诱导的mRFP-LC3点状形成。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/对稳定表达mCherry红色荧光蛋白融合LC3(mRFP-LC3)的细胞进行荧光显微镜观察紫外线照射后h(80 Jm−2), 6h彩信(0.5毫微米),8h CPT(10μM),或8h DOX(0.5μM)处理。比例尺,10微米。b条淘汰RhoB(节奏B)抑制紫外线或MMS诱导的LC3-II增加。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/细胞预处理1h,带或不带50μM氯喹(CQ)进行免疫印迹4紫外线照射后h(80 Jm−2)或6h,支持彩信(0.5mM)处理。c(c)RhoB WT而非4KR的再导入可恢复紫外线或MMS诱导的mRFP-LC3聚集。RhoB(节奏B)/用编码HA-RhoB WT或4KR的慢病毒转导稳定表达mRFP-LC3的细胞。对细胞进行免疫荧光分析4紫外线照射后h(80 Jm−2)或6彩信发送后h(0.5mM)处理。点线表示表达RhoB WT或4KR的细胞。比例尺,10微米。d日RhoB WT而非4KR的再导入可恢复紫外线或MMS诱导的LC3-II增加。RhoB(节奏B)/用HA-RoB-WT或4KR转导的细胞如图所示进行处理b条.e(电子)淘汰RhoB(节奏B)减少紫外线或MMS促进的自噬通量。RhoB公司+/+RhoB(节奏B)/8天后对稳定表达mRFP-GFP-LC3的细胞进行荧光显微镜检查h紫外线(80 Jm−2)或10h彩信(0.5mM)处理。比例尺,10微米。(f)RhoB WT而非4KR的再导入可促进紫外线或MMS治疗后的自噬通量。RhoB(节奏B)/用HA-RhoB WT或4KR转导稳定表达mRFP-GFP-LC3的细胞。对细胞进行处理并进行免疫荧光分析,如面板所示e(电子)点线表示表达RhoB WT或4KR的细胞。比例尺,10微米。淘汰RhoB(节奏B)减弱紫外线或MMS诱导的自噬体和自溶体形成。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/通过电子显微镜对细胞进行评估6紫外线照射后h(80 Jm−2)或8彩信发送后h(0.5mM)处理。放大的图像是由方框指示的区域。红色箭头表示线粒体的自噬体/自溶体
图4
图4
Sumoylated RhoB是紫外线或MMS诱导的有丝分裂和细胞死亡所必需的。b条淘汰RhoB(节奏B)紫外线或MMS处理后抑制线粒体清除。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/细胞按图3e处理并进行免疫荧光()或免疫印迹(b条). 比例尺,10微米。c(c)紫外线或MMS诱导的Hsp60下调是通过溶酶体途径实现的。预处理HeLa细胞1h(含或不含100μM CQ)按面板处理b条.d日在紫外线或MMS处理后,重新引入RhoB-WT而不是4KR下调Hsp60。RhoB(节奏B)/用HA-RhoB(WT或4KR)转导的细胞被视为小组内细胞b条.e(电子)(f)淘汰RhoB公司减少紫外线或MMS促进的有丝分裂通量。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/稳定表达线粒体裂变1蛋白mRFP-GFP-FIS1标记信号肽(残基101-152)的细胞101-152)按面板处理.比例尺,10μm。以红色荧光为主的细胞百分比进行量化并绘制在面板上(f)每个实验计算五个随机区域,三个独立实验的数据通过单因素方差分析(F(5,84) = 174.51),然后在反正弦变换后进行LSD事后检验,并表示为平均值±标准偏差((f)).小时Sumoylated RhoB是紫外线或MMS诱导凋亡所必需的。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/单元格(),或RhoB(节奏B)/用RhoB WT或4KR转导的细胞(小时)进行流式细胞术测定以确定细胞凋亡率30紫外线处理后h(80 Jm−2)或彩信(0.5mM)。采用单因素方差分析(F(5,12) = 2939.3) ()或(F(8,18) = 4854.2) (小时)然后是反正弦变换后的LSD事后检验,表示为平均值±标准偏差。双淘汰赛ULK1/2型消除RhoB促进的细胞凋亡,以应对紫外线或MMS治疗。ULK1/2型用RhoB转导WT或双敲除(DKO)MEF细胞。用流式细胞术测定细胞凋亡率24紫外线处理后h(80μm−2)或彩信(0.5mM)。采用单因素方差分析(F(17,36)===============================================================1069.3),然后在反正弦变换后进行LSD事后测试,并表示为平均值±标准偏差
图5
图5
紫外线或MMS诱导的自噬需要ATR/Chk1活性。b条紫外线或MMS诱导的LC3聚集需要ATR而非ATM活性。预处理0.5后mRFP-LC3稳定表达的HeLa细胞h带或不带ATM抑制剂CP-466722(10μM)或ATR抑制剂VE-821(1μM)进行荧光显微镜检查4紫外线照射后h(80 Jm−2)或6彩信发送后h(0.5mM)处理(). 使用Imaris x64图像分析软件量化每个细胞的红点数量。每个实验计算了五个随机区域,数据以平均值表示±三个单独实验的SD。单向方差分析(F(8,126) = 165.07),然后进行LSD事后检验以进行多重比较(b条).c(c)d日紫外线或MMS诱导的自噬需要Chk1而不是Chk2活性。预处理0.5后mRFP-LC3稳定表达的HeLa细胞h,有或没有Chk1抑制剂(0.2μM)或Chk2抑制剂-II(4μM)进行处理并进行荧光显微镜检查.每个细胞的红点定量如面板中所示b条.单向方差分析(F(8,126) = 229.17),然后进行LSD事后检验进行多重比较。e(电子)用Chk1抑制剂治疗可减弱紫外线或MMS诱导的LC3-II增加。预处理的HeLa细胞0.5h(含或不含Chk1抑制剂)(0.2μM)进行免疫印迹分析4紫外线处理后h(80 Jm−2)或6MMS治疗后h(0.5mM)。(f)敲除Chk1可降低紫外线或MMS处理促进的自噬通量。对稳定表达mRFP-GFP-LC3和对照shRNA(sh-Con)或shRNA对抗Chk1(sh-Chk1-1或sh-Chg1-2)的HeLa细胞进行荧光显微镜观察紫外线处理后h(80 Jm−2)或10MMS处理后h(0.5mM)。比例尺,10微米
图6
图6
Chk1磷酸化RhoB以促进其sumoylation和易位到溶酶体。Chk1活性是RhoB易位到溶酶体所必需的。预处理的HeLa细胞0.5h,有或没有Chk1抑制剂(0.2μM)进行免疫荧光检测2紫外线照射后h(80 Jm−2)或4彩信发送后h(0.5mM)治疗以检查内源性RhoB和LAMP1的定位。比例尺,10微米。b条Chk1活性对于UV或MMS诱导的内源性RhoB的酰化是必不可少的。将表达His-SUMO2的HeLa细胞作为对照然后进行酰化反应。用RhoB抗体免疫印迹法检测RhoB的SUMO2结合。c(c)Chk1与内源性RhoB相互作用。用标记的Chk1-D130A突变体(F-Chk1-D230A)转导的HeLa细胞进行抗RhoB IP,然后用抗Chk1进行免疫印迹,以检测相关的F-Chk1-D130A。d日Chk1在RhoB的苏氨酸残基上磷酸化RhoB。体外激酶分析如方法磷酸化RhoB通过使用磷酸-三氢嘌呤或磷酸-胺抗体的免疫印迹检测。e(电子)Chk1在Thr173和Thr175磷酸化RhoB。使用从细菌中纯化的RhoB WT或T173175A突变体(2A)进行体外激酶分析。(f)Chk1对RhoB的磷酸化促进其与PIAS1的结合。表达标志性PIAS1(F-PIAS1)和HA标记野生型(WT)、T173175E(2E)或T173175组合的HEK293T细胞对A(2A)RhoB进行共免疫沉淀试验1经过或不经过紫外线处理后h(80 Jm−2)检测相关RhoB。紫外线或MMS诱导的sumoylation需要通过Chk1使RhoB磷酸化。对具有HA标记的SUMO2(HA-SUMO2)和His标记的RhoB(WT、2E或2A)的指示组合表达的HEK293T细胞进行sumoyalization测定1紫外线处理后h(80 Jm−2)或2MMS处理后h(0.5mM)检测RhoB的SUMO2结合。小时Chk1介导的磷酸化对紫外线或MMS诱导的RhoB溶酶体易位至关重要。对表达HA标记RhoB(WT、2E或2A)的U2OS细胞进行免疫荧光分析4紫外线处理后h(80 Jm−2)或彩信(0.5mM)。比例尺,10微米
图7
图7
磷酸化和sumoylated RhoB将TSC2招募到溶酶体以抑制mTORC1活性。淘汰RhoB(节奏B)防止紫外线或MMS诱导的磷酸化ULK1和S6K的下调。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/细胞进行免疫印迹分析2紫外线照射后h(80 Jm−2)或4彩信发送后h(0.5mM)。b条RhoB的酰化是UV或MMS诱导的磷酸化ULK1和S6K下调所必需的。RhoB(节奏B)/用HA-标记的RhoB(WT或4KR)转导的细胞进行处理,并进行免疫印迹分析.c(c)紫外线或MMS处理诱导内源性RhoB和TSC2的共定位。HeLa细胞被视为小组内细胞免疫荧光法检测内源性RhoB和TSC2的定位。比例尺,10微米。d日淘汰RhoB(节奏B)减弱紫外线或MMS处理后TSC2向溶酶体的易位。RhoB(节奏B)+/+RhoB(节奏B)/细胞按面板处理并进行免疫荧光检测内源性TSC2和LAMP1的共定位。e(电子)RhoB的Sumoylation对紫外线或MMS诱导的TSC2溶酶体易位至关重要。RhoB(节奏B)/用HA-标记的WT或4KR RhoB转导的细胞按小组处理并进行免疫荧光分析。点划线勾勒出具有RhoB-WT或4KR表达的细胞的轮廓。比例尺,10微米。(f)紫外线或MMS处理增强RhoB和内源性TSC2之间的相互作用。HeLa细胞被视为小组内细胞并进行抗TSC2免疫沉淀,然后进行免疫印迹检测相关RhoB。RhoB的磷酸化是通过UV或MMS处理诱导其与TSC2相互作用所必需的。用HA标记的RhoB(WT、2E或2A)转导的HeLa细胞进行处理,进行抗TSC2免疫沉淀和免疫印迹.小时RhoB的Sumoylation不负责其与TSC2的结合。用HA标记的RhoB(WT或4KR)转导的HeLa细胞进行处理,进行抗TSC2免疫沉淀和免疫印迹

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