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.2018年9月25日：11:6197-6207。
doi:10.2147/OTT。第175810条。 2018年eCollection。

SOX2，一种干性基因，诱导NSCLC A549细胞向锚定非依赖性生长和对长春碱的化学耐药性发展

忠友町 1, Hyewon Kim先生 2, Sol最小值 2, 桑圭公园 2 三, 郑敏熙 2 三, Sangho Roh公司 2
附属公司

SOX2是一个干细胞基因，诱导NSCLC A549细胞向凤尾鱼非依赖性生长和对长春花碱的耐药性发展

Chungyoul Choe先生等。 Onco目标Ther. .

摘要

背景：非小细胞肺癌（NSCLC）很难成功治疗。这种顽固性主要是由于癌症通过侵袭、转移、化疗抵抗和复发而进展。干细胞与多种肿瘤中癌症进展的不同步骤有关，但对其在非小细胞肺癌中的作用知之甚少。

目的：在这项研究中，我们试图确定SOX2（多能性的主要调节因子）在肿瘤进展过程中细胞外基质（ECM）分离细胞的生长中的作用。

方法：我们建立了肺腺癌（LUAD）A549细胞的三维（3D）聚甲基丙烯酸羟乙基酯（Poly-HEMA）培养物，作为ECM分离细胞生长模型，并使用siRNA和小分子抑制剂与标准二维（2D）培养物比较，检查了干细胞基因的作用。

结果：在poly-HEMA培养中，A549细胞形成具有中间上皮-间充质转化（EMT）特征的基质分离球体，SOX2的表达高于对照2D细胞。SOX2的敲除显著抑制了A549细胞聚集物在多聚HEMA培养条件下的生长，并进一步增加了其对抗癌药物长春碱的敏感性，同时伴随着抗凋亡AKT激酶活性的下调。有趣的是，替代SOX2的小分子RepSox在poly-HEMA 3D培养条件下刺激A549细胞生长。

结论：我们的研究结果强烈表明，SOX2通过其下游信号介质AKT激酶在非小细胞肺癌疾病进展过程中促进凤尾鱼非依赖性生长和耐药性。因此，SOX2可能是非小细胞肺癌无价的治疗靶点。

关键词：EMT；非小细胞肺癌；SOX2；肺癌；茎干；长春碱。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露作者报告在这项工作中没有利益冲突。

数字

图1
图1
NSCLC A549细胞的代表性图像显示了正常培养皿（2D，左图）和聚HEMA包被皿（3D，右图）中的细胞间和细胞内结构。培养72小时后拍摄图像。笔记：(A类)相控显微照片显示了在2D（左）和3D（右）培养基中生长的人类NSCLC A549细胞的形态。原始放大倍数：×1000。比例尺：200µm。(B类)在2D（左）和3D（右）培养基中生长的NSCLC A549细胞的典型荧光显微图像。细胞用靶向α-SMA（绿色）和罗丹明结合的卵磷脂（F-actin，红色）的抗体染色，而细胞核用DAPI复染成蓝色。使用共焦荧光显微镜对细胞成像。左边的图像是DAPI、α-SMA和卵磷脂染色的合并图像。照片是n=3个实验的代表。原始放大倍数：×1500。比例尺：50µm。(C类)在2D（左）和3D（右）培养基中生长的NSCLC A549细胞的典型SEM图像。照片是n=3个实验的代表。缩写：非小细胞肺癌；SEM、扫描电子显微镜；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；二维，二维；3D，三维；聚-HEMA，聚甲基丙烯酸甲酯-2-羟乙基酯。
图2
图2
A549细胞球形体的基因表达模式。笔记：(A类)EMT标记（CDH1、CDH2、SNAI1和ZEB1）、细胞周期标记（MKI67、GADD45A和CDKN1A）和多功能标记（OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC和NANOG）转录水平的实时定量RT-PCR。所示数据代表两个独立实验，数值代表三份样品的平均值±SD。每个mRNA的表达均与同一样本中GAPDH mRNA的表现标准化，并呈现为2D培养对照细胞的折叠变化。使用单侧法评估表达水平差异的显著性t吨-不等方差检验(*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001). (B类)Western blot检测蛋白表达变化。β-肌动蛋白被用作内部控制。缩写：上皮-间充质转化；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；二维，二维；3D，三维。
图3
图3
SOX2 siRNA敲除对基因表达模式和球体生长的影响。笔记：(A类)转染SOX2 siRNA后SOX2的下调。siRNA转染后四天，收获细胞以验证SOX2蛋白的敲除，通过蛋白质印迹评估的蛋白表达证明了这一点。β-肌动蛋白被用作内部控制。(B类)显示siRNA转染后人类NSCLC A549细胞在2D（上图）和3D（下图）培养物中生长的相差显微照片。约5×104如“材料和方法”部分所述，将细胞置于六孔板中，并转染SOX2 siRNA。原始放大倍数：×1000。比例尺：100µm。(C类)非小细胞肺癌A549细胞的剂量反应存活曲线。用不同浓度的RepSox处理细胞72小时。用ATP测定细胞存活率，并在A549细胞的2D和3D培养物中测定长春碱的IC50。数据表示为车辆处理的对照细胞百分比（设为100%细胞存活率）。每个实验至少重复两次，一式三次，结果相似，并且使用Sigma图将代表性实验的药物反应数据拟合到非线性S形模型。值表示一个代表性实验中三份样品的平均值±SD。IC的显著差异50使用学生的未配对t吨-测试*P（P）与2D培养相比<0.05。缩写：Ctrl，控制；NC，阴性对照；非小细胞肺癌；二维，二维；3D，三维。
图4
图4
SOX2对A549细胞长春碱耐药性的作用。笔记：(A类)非小细胞肺癌A549细胞的剂量反应存活曲线。将转染有对照siRNA或SOX2 siRNA的细胞置于96-well板中，然后用不同浓度的长春碱处理72小时。用ATP测定细胞存活率，并在A549细胞的2D和3D培养物中测定长春碱的IC50。数据表示为车辆处理的对照细胞百分比（设为100%细胞存活率）。每个实验重复至少两次，一式三次，结果相似。值表示一个代表性实验中三份样品的平均值±SD。与车辆控制的显著差异的统计分析（*），P（P）< 0.05. (B类)SOX2敲除对长春碱激活AKT激酶的影响。在长春碱以10 nM的IC50处理三天后，收集细胞，通过Western blotting评估AKT的磷酸化水平。β-肌动蛋白被用作内部控制。(C类)长春碱处理后多能性基因转录水平的实时定量RT-PCR。所示数据代表两个独立实验，数值代表三份样品的平均值±SD。在同一样本中，每种mRNA的表达均与GAPDH mRNA的表现标准化，并呈现为与载体处理的2D培养对照细胞相比的折叠变化。使用单侧法评估表达水平差异的显著性t吨-不等方差检验(*P（P）<0.01, ***P（P）<0.001).缩写：GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；非小细胞肺癌。
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