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.2018年11月23日；293(47):18242-18269.
doi:10.1074/jbc。RA117.001245。 Epub 2018年10月3日。

一种鼻内应用的多糖Mini-AGR激活神经元Nrf2介导的抗氧化防御系统

凯尔西·墨菲 1, 基利安·卢埃林 1, 塞缪尔·瓦克瑟 1, 约瑟夫·蓬塔什 1, 娜塔莎·萨马尼奇 1, 马修·弗莱默 1, 肯尼思·汉斯莱 2, Dong-Shik Kim先生 三, 约书亚公园 4
附属公司

一种鼻内应用的多糖Mini-AGR激活神经元Nrf2介导的抗氧化防御系统

凯尔西·墨菲等。 生物化学杂志. .

摘要

氧化应激触发并加剧阿尔茨海默病（AD）的神经退行性变。各种抗氧化剂可以减少氧化应激，但由于血脑屏障（BBB）通透性差，这些药物几乎没有疗效。此外，单峰抗氧化剂很容易被全球氧化应激所压倒。激活核因子红细胞样2（NF-E2）相关因子2（Nrf2）及其下游抗氧化系统被认为对减少全球氧化应激非常有效。到目前为止，只有少数BBB渗透剂激活Nrf2依赖的抗氧化系统。在这里，我们发现了一种BBB绕过Nrf2激活的多糖，可以减弱AD发病机制。Mini-AGR是低酰基结冷胶的0.7-kDa裂解产物，可提高Nrf2依赖性抗氧化酶的水平和活性，降低小鼠皮层神经元在氧化应激下的活性氧物种（ROS），并有效保护线粒体免受氧化损伤。此外，与已知的Nrf2激活物类似，mini-GAGR增加了Nrf2的核定位和转录活性。从机制上讲，mini-GAGR增加了Nrf2与其抑制剂Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）的分离，并以蛋白激酶C（PKC）和成纤维细胞生长因子受体（FGFR1）依赖的方式诱导Nrf2磷酸化和核移位。最后，用100 nmol mini-GAGR对3xTg-AD小鼠进行20天的鼻内治疗，可增加海马神经元中的核p-Nrf2和生长相关蛋白43（GAP43）水平，减少p-tau和β-淀粉样蛋白（Aβ）肽染色神经元，并改善记忆。本文报道的BBB旁路Nrf2激活多糖可能有效降低AD的氧化应激和神经变性。

关键词：阿尔茨海默病；BBB-旁路多糖；淀粉样蛋白；抗氧化剂；抗氧化酶；mini-AGR；神经变性；核因子2（类红细胞衍生因子）（NFE2L2）（Nrf2）；氧化应激；多糖；陶。

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数字

图1。
图1。
小鼠皮层神经元mini-GAGR质谱及其对抗氧化酶蛋白的影响。 A类，mini-AGR的质谱。MALDI-MS显示迷你GAGR的分子量（～720Da）。B类mini-AGR的基本结构。C–H型，小鼠皮层神经元（E17，DIV11-14）用载体（对照）或1μ米微型AGR(迷你)48小时，并使用抗氧化酶抗体、GAPDH和β-肌动蛋白进行免疫印迹（负荷控制）。用ImageJ定量蛋白质的带密度，以获得平均带密度±S.E(误差线)用于条形图。C类，HO1（32 kDa）(第页= 0.0364,n个=8个不同的胚胎批次）；天，SOD1（16 kDa）(第页= 0.0243,n个=12个不同的胚胎批次）；E类，GR（60 kDa）(第页=0.00515，n个=10个不同的胚胎批次）；F类，GPx4（21 kDa）(第页= 0.0103,n个=5个不同的胚胎批次）。与对照组（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; 未成对的t吨测试，双尾）。数据表示为平均值±S.E。每个分子质量标记都有标记在旁边每个污点(例如98K表示98000 Da）。
图2。
图2。
Mini-AGR增加Nrf2的核转位和转录因子活性。 A类，用1μ米mini-AGR用于0、1、3、6和24小时，并用Nrf2抗体进行免疫细胞化学处理(绿色; Alexa Fluor 488），βIII微管蛋白(红色; Alexa Fluor 594）和DAPI(蓝色) (比例尺，30μm）。B类通过免疫印迹未经处理的小鼠皮层神经元的胞浆，证实了抗Nrf2抗体（80kDa）的特异性。C类，用变形金刚定量图像中核Nrf2的荧光强度，计算平均强度±S.E(误差线)核Nrf2染色在时间过程中的变化，用于条形图：与对照组比较，3小时(第页< 0.001,n个=30个电池）和6小时(第页=0.058，n个=30个单元格）。（单向方差分析（F（4145）=6.2641，第页<0.001）和Bonferroni的多重比较试验）。天，在mini-GAGR处理3 h后，通过450 nm处的吸光度测量Nrf2的转录因子活性，以条形图为对照（0.094±0.002，n个=8个不同批次的胚胎）和mini-AGR（0.124±0.005，n个=8个不同的胚胎批次）(第页<0.001）（***，第页< 0.001; 未成对的t吨测试，双尾）。
图3。
图3。
mini-GAGR与其他Nrf2活化剂的比较。 A类，小鼠皮层神经元（E17，DIV11-14）用载体（对照）处理，1μ米迷你GAGR，1μ米midi-GAGR，6μg/ml DMF或100 n米CDDO-TFEA 3 h，并用Nrf2抗体进行免疫细胞化学处理(绿色; Alexa Fluor 488），βIII微管蛋白(红色; Alexa Fluor 594）和DAPI（未显示）(比例尺，30μm）。这个插入显示每个代表性的核Nrf2染色。B类，用变形金刚定量图像中核Nrf2的荧光强度，计算平均强度±S.E(误差线)用于条形图(n个=76–80核）：对照与mini-GAG、midi-GAGR、DMF和CDDO(第页< 0.001) (F类(4, 509) = 87.888,第页<0.001，方差分析）。（值得注意的是，由于每个条件下的测量总数对于散点图来说太大，因此使用了条形图。）C类，Nrf2的转录因子活性在载体（对照）处理后3小时通过450 nm处的吸光度测定，1μ米微型AGR，1μ米midi-GAGR，6μg/ml DMF或100 n米CDDO-TFEA公司。条形图，控制与微型AGR和控制与DMF公司(n个=8个不同的胚胎批次，第页<0.001）（F（4，35）=12.668，第页<0.001，方差分析）。天和E类，小鼠初级皮层神经元（E17，DIV11-14）用1μ米微型AGR，1μ米midi-GAGR，6μg/ml DMF或100 n米CDDO-TFEA 48小时，并使用SOD1（16kDa）和GPx4（21kDa。通过ImageJ量化蛋白质的带密度，以获得条形图的平均带密度±S.E。天，SOD1(n个=4个不同的胚胎批次）：对照与微型AGR(第页=0.003），控制与迷笛(第页<0.001），对照与DMF公司(第页=0.034）和控制与CDDO-有限元分析(第页<0.001）（F（4，15）=11.566，第页<0.001，方差分析）。E类，GPx4(n个=4个不同的胚胎批次）：对照与微型AGR(第页=0.007），控制与midi-GAGR公司(第页=0.010），控制与DMF公司(第页=0.020），控制与CDDO-TFEA公司(第页=0.005）（F（4，15）=5.5698，第页=0.006，方差分析）。(*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，单因素方差分析和Bonferroni的多重比较试验。）数据表示为平均值±S.E。
图4。
图4。
Mini-GAGR增加氧化应激下神经元中HO-1的蛋白水平和SOD的酶活性，并降低4HNE诱导的氧化应激。 A类，小鼠皮层神经元（E17，DIV11-14）用载体或1μ米mini-AGR 16小时，用载药10μ米4HNE或50μ米H（H）2O（运行）2免疫印迹、酶测定和自由基测定前30小时。抗氧化酶蛋白的条带密度通过ImageJ进行定量，以获得平均密度±S.E(误差线). 利用对照条件下每个蛋白质的平均密度计算不同条件下蛋白质的倍差。B类，HO-1（4HNE与HNE+迷你型：第页= 0.038,n个=3个不同的胚胎批次）。HO-1在对照组和mini-AGR组之间的蛋白质水平存在显著差异，具有统计学意义(第页=0.034，n个=7个不同的胚胎批次（F（4，15）=5.1797，第页=0.008，方差分析）(B类)、超氧化物歧化酶(第页= 0.044,n个=7个不同的胚胎批次（F（4，39）=1.7323，第页=0.162，方差分析）(C类)，CAT（趋势，第页= 0.055,n个=7个不同的胚胎批次（F（4，31）=1.887，第页=0.138，方差分析）(天)，希腊(第页= 0.022,n个=7个不同的胚胎批次）(F类)和GPx4(第页= 0.022,n个=5个不同的胚胎批次）(G公司). 单独自由基组（4HNE）的蛋白质水平无统计学显著差异(海航集团)或H2O（运行）2)SOD的自由基和mini-AGR(n个=7个不同的胚胎批次）(C类)、CAT(n个=7个不同的胚胎批次）(天)、NQO1(n个=7个不同的胚胎批次（F（4，31）=0.36323，第页=0.833，方差分析）(E类)，希腊(n个=7个不同的胚胎批次（F（4，27）=0.64436，第页=0.636，方差分析）(F类)和GPx4(n个=5个不同的胚胎批次（F（4，32）=2.7775，第页=0.044，方差分析）(G公司).H（H），SOD活性（单位/ml）(n个=8个不同的胚胎批次）：对照与微型AGR(第页<0.001），HNE与HNE+小型通用汽车(第页=0.028）（F（5,42）=13.466，第页<0.001，方差分析）。我，ROS水平（HNE与HNE+mini-AGR：第页= 0.006,n个=24个不同的胚胎批次（F（5138）=3.496，第页=0.005，方差分析）。J型MDA水平（HNE与HNE+mini-AGR：第页=0.006，n个=3个不同的胚胎批次（F（5，12）=3.989，第页=0.023，方差分析）。(*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，单因素方差分析和Bonferroni的多重比较试验）。数据表示为平均值±S.E。
图5。
图5。
Mini-AGR保护线粒体和MMP免受氧化应激。 A类，小鼠皮层神经元（E17，DIV11-14）用载体（对照）或1μ米微型AGR(迷你)16小时，用载体处理，10μ米4HNE公司(海航集团)，或50μ米H（H）2O（运行）2MitoTracker之前30小时(A类)或JC-1(B类)染色。细胞体中MitoTracker的强度(CB（断路器）) (C类)和神经突(天)用Metamorph软件对固定神经元的数量进行量化。C类，平均强度±S.E(误差线)细胞体中的MitoTracker染色(n个=100个细胞体）：对照与氢萘(第页<0.001），对照与H（H）2O（运行）2(第页<0.001），HNE与HNE+小型通用汽车(第页<0.001），H2O（运行）2 与H（H）2O（运行）2+微型AGR(第页<0.001）（F（5638）=115.97；第页<0.001，方差分析）。天，神经突中MitoTracker的平均强度±S.E(n个=120个神经突）：对照与微型AGR(第页<0.001），对照与海航集团(第页<0.001），对照与H（H）2O（运行）2(第页<0.001），HNE与HNE+小型通用汽车(第页<0.001），H2O（运行）2 与H（H）2O（运行）2+微型AGR(第页<0.001）（F（5746）=241.14；第页<0.001，方差分析）。E类、JC-1(n个=200个细胞体）：对照与海航集团(第页<0.001），对照与H（H）2O（运行）2(第页<0.001），HNE与HNE+小型通用汽车(第页<0.001），H2O（运行）2 与H（H）2O（运行）2+微型AGR(第页<0.001）（F（51428）=445.69；第页<0.001，方差分析）。***，第页<0.001，单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验；比例尺，30μm）。数据表示为平均值±S.E.（值得注意的是，由于每个条件下的总测量次数超过100次，因此散点图未用于条形图。）
图6。
图6。
Mini-GAGR减少了Keap1和Nrf2之间的共定位和相互作用。 A类和B类，用1μ米微型AGR(迷你)持续0小时(A类)和3小时(B类)用Nrf2的一级抗体进行免疫细胞化学处理(绿色)和Keap1(红色)和二级抗体（Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594）、皮尔逊共定位系数R（右）使用ImageJ进行量化。比例尺，30微米。C类，小鼠皮层神经元（E17，DIV 14）用载体（对照）或1μ米微型AGR(迷你)持续3 h，并使用对照IgG或抗Nrf2 IgG（α编号2). 用ImageJ定量沉淀Nrf2（80 kDa）和Keap1（70 kDa(误差线)用于条形图。天，Nrf2，控制与微型发电机。E类，Keap1，控制与微型AGR(n个=3个不同的胚胎批次；*，第页< 0.05; 学生的t吨测试，双尾）。数据表示为平均值±S.E。
图7。
图7。
Mini-AGR以PKC和FGFR1依赖的方式诱导Nrf2磷酸化和核定位。 A类，用1μ米微型AGR(迷你)持续3 h并进行免疫印迹处理（p-Ser-40-Nrf2和Nrf2）。磷酸化-Nrf2（100kDa）的能带密度(B类)和总Nrf2（80 kDa）(C类)通过ImageJ进行量化，以获得平均密度±S.E(误差线)p-Nrf2的(第页< 0.001,n个=3个不同的胚胎批次），Nrf2蛋白浓度(n个=3个不同的胚胎批次）（学生的t吨测试，双尾）。天，用载体或3n预处理初级皮层神经元（E17，DIV14）米Stau（PKC抑制剂）2小时，并用溶媒（对照）或1μ米在测量PKC活性之前，进行3小时的mini-AGR(n个=8个不同的胚胎批次）：对照与微型AGR(迷你) (第页=0.008），控制与体育场(第页=0.017），控制与Stau+迷你-GAGR(第页=0.047），最小AGR与Stau+迷你-GAGR(第页<0.001）（单向方差分析（F（3,60）=14.631，第页<0.001，ANOVA和Bonferroni的多重比较试验）。E–G公司，用载体预处理原代皮层神经元（E17，DIV14），3 n米staurosporine或50n米PD173074（FGFR1抑制剂）2小时，用1μ米免疫印迹（p-Nrf2和Nrf2）前，mini-AGR 3小时。E类，通过ImageJ量化抗氧化酶蛋白质的带密度，以获得条形图的平均密度±S.E.：对照与微型AGR(n个=4个不同的胚胎批次，第页<0.01（F（5，第页<0.001，方差分析）。F类和G公司，初级皮层神经元（E17，DIV14）用载体预处理，3n米staurosporine或50n米PD173074 2 h，用1μ米免疫细胞化学（Nrf2）前3小时mini-AGR(绿色; Alexa Fluor 488），βIII-管蛋白(红色; Alexa Fluor 594），DAPI）。F类，用变形金刚对图像中核Nrf2的荧光强度进行量化，以计算条形图中核Nrf2染色的平均强度±S.E(n个=100–123个单元格）：对照与mini-GAG、Stau、Stau+mini-GAR、PD、PD+mini-AGR(第页< 0.001); 微型AGR与Stau+mini-GAG、PD+mini-AGR(第页<0.001）（F（5877）=137.67，第页<0.001，方差分析）。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.001，单因素方差分析和Bonferroni的多重比较试验）。数据表示为平均值±S.E(比例尺，30μm）。（值得注意的是，由于每个条件的总测量次数超过100次，因此散点图未用于图表。）
图8。
图8。
Mini-AGR绕过BBB，增加12个月大雌性3xTg-AD小鼠大脑中的HO-1、SOD1，可能还有GPx4。 A类，ANTS在脑细胞溶胶中的标准曲线，用于将ANTS的荧光值转换为与ANTS结合的mini-GAGR浓度（ANTS/mini-GAGR=1:10）。B类将100 nmol/40μl ANTS标记的迷你GAGR或载体（水）注射到10个月大的WT小鼠的鼻孔中（平均体重~25 g，n个=4只动物/治疗组）。从小鼠大脑中提取脑细胞液，并用于量化条形图中的ANTS–mini-GAGR（平均浓度±S.E(误差线)ANTS–mini-AGR与车辆；***，第页< 0.001).C类3xTg-AD小鼠经鼻给药载体（对照）或100 nmol mini-GAGR 20天(n个=6只动物/治疗组），并处理以获得海马和皮层联合组织的胞浆用于免疫印迹。通过ImageJ定量细胞溶质中抗氧化酶的条带密度，以获得条形图的平均密度±S.E。天，HO-1（32 kDa）：控制与微型AGR（*，第页< 0.05);E类，SOD1（16 kDa）：控制与微型AGR（*，第页< 0.05);F类，GPx4（21 kDa）：控制与微型AGR（*，第页=0.525）；G公司，NQO1（31 kDa）：控制与mini-AGR；H（H），CAT（64 kDa）：控制与mini-AGR；我，β-肌动蛋白（45 kDa）：对照与微型发电机。(*,第页< 0.05; ***,第页< 0.001; 未成对的t吨测试，双尾）。数据表示为平均值±S.E。
图9。
图9。
在12个月大的雌性3xTg-AD小鼠大脑中，Mini-AGR减少Keap1和Nrf2之间的相互作用，并增加海马神经元中的p-Nrf2。 A类用载体或100 nmol mini-GAGR处理20天的3xTg-AD小鼠的大脑皮层细胞液，使用对照IgG或抗Nrf2 IgG进行co-IP。免疫印迹法检测沉淀Nrf2和Keap1。通过ImageJ量化沉淀Nrf2和Keap1的带密度，以获得平均密度±S.E(误差线)用于条形图。B类，Nrf2（80 kDa）：控制与微型发电机。C类，Keap1（70 kDa）：控制与微型AGR(n个=3只动物/治疗；*，第页< 0.05).天和F类、3xTg-AD小鼠的海马部分用任一载体处理(天)或100 n米微型AGR(F类)用NeuN抗体染色(红色; Alexa Fluor 594）和p-Nrf2(绿色; Alexa Fluor 488）和DAPI(蓝色) (比例尺250μm）。E类和G公司3xTg-AD小鼠免疫染色海马CA1区的放大图像(E类)或100 n米微型AGR(G公司) (比例尺，50微米）。H（H），用1μ米用3h来确认抗p-Nrf2抗体的特异性。我条形图显示了3xTg-AD小鼠经载体或100n处理后海马CA1-CA3和DG区p-Nrf2染色强度的倍变化米微型AGR(n个=6只动物（14节）/治疗，第页= 0.059; **,第页< 0.01).J型，条形图显示了用载体或100 n处理的3xTg AD小鼠的p-Nrf2阳性海马CA1–CA3和DG区的-倍变化米微型AGR(n个=6只动物（14节）/治疗；***，第页< 0.001). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; 未成对的t吨测试，双尾）。数据表示为平均值±S.E。
图10。
图10。
在12个月大的雌性3xTg-AD小鼠大脑中，Mini-GARG减少p-tau和Aβ肽，并改善学习和记忆保持能力。 A类和B类用载体或100 nmol mini-GAGR处理20天的3xTg-AD小鼠海马和皮层联合组织的胞浆用于p-tau和tau的免疫印迹。用ImageJ量化τ和p-tau的带密度，以获得平均密度±S.E(误差线)条形图：tau（50 kDa）：控制与微型AGR(C类); p-tau（64 kDa）：对照与微型AGR(n个=5只动物；**，第页< 0.01) (天).E类和F类、3xTg-AD小鼠的海马部分用任一载体处理(E类)或100 n米微型AGR(F类)用抗Aβ抗体（6E10）和HRP标记的二级抗体染色(比例尺250μm）。G公司条形图显示了3xTg-AD小鼠经载体或100n处理后Aβ阳性海马CA1-CA3和DG区域的平均数量米微型AGR(n个=6只动物（15节）/治疗；**，第页< 0.01).G–J型，用载体或100n处理的3xTg AD小鼠米mini-AGR连续14天，采用开放场范式测量基础运动功能。车辆处理无差异与mini-AGR–处理小鼠的平均速度（cm/s）(H（H）)和总距离（cm）(我).J型和K（K），测定mini-GAG对3xTg-AD小鼠学习记忆的影响(n个=7只小鼠/治疗组），执行Barnes迷宫范式。J型，训练天数的主要潜伏期：载体处理的小鼠与mini-AGR处理小鼠(n个=35次总训练试验）：训练第1天(第页=0.0309），训练第2天(第页=0.0016），训练第3天(第页= 0.00234).K（K），记忆保留的主要潜伏期：车辆处理小鼠与迷你GAGR治疗小鼠：记忆保留(第页= 0.0587) (*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001; 未成对的t吨测试，双尾）。数据表示为平均值±S.E。
图11。
图11。
在12个月大的雌性3xTg-AD小鼠大脑中，Mini-AGR增加海马体及其附近皮层中的PSD95和GAP43。 A类用100 nmol mini-GAGR处理20天的3xTg-AD小鼠海马和皮层联合组织的胞浆用于GAP43、PSD95和肌动蛋白的免疫印迹。用ImageJ定量GAP43和PSD95的带密度，以获得平均密度±S.E(误差线)条形图：GAP43（～38 kDa）控制与微型AGR(B类)和PSD95（180 kDa）(n个=6只动物；*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001) (C类).天和E类，3xTg-AD小鼠的海马部分用任一载体治疗(天)或100 n米微型AGR(E类)用GAP43抗体染色(绿色; Alexa Fluor 488）和NeuN(红色; Alexa Fluor 594）和DAPI(蓝色). 显示的是这种染色的合并。F类散点图显示了3xTg-AD小鼠经载体或100n处理后GAP43阳性海马CA1-CA2和CA3区域的平均数量米微型AGR(n个=6只动物（12个切片）/治疗；**，第页< 0.01) (*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001; 未成对的t吨测试，双尾）。数据表示为平均值±S.E。
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