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.2018年12月15日;27(24):1702-1714.
doi:10.1089/scd.2018.0010。 Epub 2018年11月20日。

移植人多能干细胞衍生间充质干细胞支持Gunn大鼠肝再生

附属公司

移植人多能干细胞衍生间充质干细胞支持Gunn大鼠肝再生

卢卡斯·塞巴斯蒂安·斯皮佐恩等。 干细胞开发. .

摘要

冈恩大鼠尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶-1a1发生突变(Ugt1a1型)Crigler-Najjar综合征中导致高血清胆红素水平的基因。在本研究中,Gunn大鼠被用作遗传性肝功能障碍的动物模型。将胚胎干细胞(H1)诱导的间充质干细胞(iMSCs)和诱导的多能干细胞移植到肝部分切除后的Gunn大鼠体内。iMSCs移植后在肝脏中存活长达2个月。移植的iMSCs分化为功能性肝细胞,部分抑制高胆红素血症和多种人类特异性肝细胞标记物的表达,如白蛋白、肝细胞核因子4α、,UGT1A1型细胞角蛋白18、胆盐输出泵、多药耐药蛋白2、钠/牛磺胆酸转运多肽和α-甲胎蛋白。这些发现表明,移植的人iMSCs可以促进体内肝脏再生,因此是治疗遗传性肝病的一种有希望的工具。

关键词:电子稳定控制系统;胎儿MSC;国际MSC;iPSC;肝再生;干细胞移植。

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不存在竞争性财务利益。

数字

<b>图1</b>
图1。
通过免疫荧光和转录组分析鉴定iMSCs。(A)从人类ESC线H1和fMSC生成iMSC的方案。用TGF-β受体抑制剂SB-431542处理表达多潜能相关标记物OCT4的ESCs 14天,以促进其分化为iMSCs,同时OCT4表达缺失,出现表达MSC标记物PDGFRβ的成纤维细胞样细胞。为了从fMSCs生成iMSCs,首先使用编码多潜能因子的质粒将细胞重新编程为表达多潜能OCT4的iPSC华侨城4号,SOX2标准,c-MYC公司,KLF4型,NANOG公司、和第28行经SB-431542治疗后,iPSC分化为OCT4/PDGFRβ+ESC-iMSC观察到的iMSC。细胞核用Hoechst 33258染色(蓝色),带FITC的OCT4(绿色)和PDGFRβ与Cy3(红色).(B)通过基因表达阵列分析(欧氏相关分析)对ESC和iPSC-derived iMSCs进行表征。对每种细胞类型的代表性制剂进行一次转录组分析。(C)这些转录组数据的Pearson相关分析显示出高度相关性(绿色)iMSCs与fMSCs的相关性均较低(红色)以及它们的多能前体(ESCs和iPSC)。比例尺表示200微米。ESC,胚胎干细胞;fMSC,胎儿间充质干细胞;诱导间充质干细胞;诱导多能干细胞;OCT4,八聚体结合转录因子4;血小板衍生生长因子受体β;SOX2,SRY(性别决定区Y)-框2;TGF-β,转化生长因子-β。
<b>图2</b>
图2。
通过流式细胞术对fMSCs和iMSCs进行表征。MSC标记(A–C)CD73,(D–F)CD90和(G–I)CD105在来源于ESCs和iPSCs的fMSCs和iMSCs上可作为细胞表面蛋白检测到,而造血标记物的表达(J–L)CD14、CD20、CD34和CD45较低(深蓝色).浅蓝色直方图表示抗体同型对照。显示了每种细胞类型重复分析的代表性数据(fMSCsn个 = 4; ESC-IMSC系统n个 = 3;和iPSC-iMSCn个 = 4). 特定细胞表面标记的阳性细胞百分比表示为平均值±不同分析的SEM。SEM,平均值标准误差。
<b>图3</b>
图3。
fMSC和iMSC的功能表征。通过定性分析、成脂分化培养基(fMSC:n个 = 7; ESC-iMSC公司:n个 = 3;和iPSC-iMSC:n个 = 3) ,软骨生成(fMSC:n个 = 2; ESC-iMSC公司:n个 = 3;和iPSC iMSC:n个 = 2) 和成骨(fMSC:n个 = 5;ESC-iMSC公司:n个 = 3;和iPSC-iMSC:n个 = 3) 显影时间为21天。(A1–D1)fMSC和iMSC(A2–D2,ESC-iMSCs;A3–D3,iPSC-iMSC)显示(A1–A3)成纤维细胞样形态,能够分化为(B1–B3)脂肪细胞(油红O染色的脂滴),(C1–C3)软骨细胞(软骨中Alcian Blue 8GX标记的糖胺聚糖),以及(D1–D3)成骨细胞(茜素红染色的钙沉积)。比例尺指示50微米(B2、C1), 100微米(B1、B3、C2), 200微米(A1–A3、D2、D3)、和500微米(C3、D1).
<b>图4</b>
图4。
移植的人iMSCs在宿主Gunn大鼠中获得肝细胞功能。(A)转录组分析证实移植前多能干细胞以及fMSCs和iMSCs中缺乏肝细胞标记物表达,但表明结缔组织标记物和α-SMA(欧几里德相关分析),通常由MSC表示。对每种细胞类型的代表性制剂进行一次转录组分析。(B)此外,培养的fMSCs和iMSCs没有像人特异性ALB ELISA检测的那样将ALB分泌到培养基中。健康志愿者的人血清中ALB的正常水平表示为平均值(3.6克/分升;n个 = 3).(C)Gunn大鼠血清中存在人ALB,表明移植的人ESC-iMSCs和iPSC-iMSCs分化为肝细胞。(D)移植人ESC-iMSCs后,Gunn大鼠血液中总胆红素浓度显著降低,但iPSC-iMSCs无显著性差异(C、D:控制n个 = 4; ESC-iMSC公司:n个 = 3;iPSC-iMSC:n个 = 3; *P(P) < 0.05)正常野生型大鼠的平均胆红素水平(WT,0.1mg/dL)由a表示虚线[29]. ALB,白蛋白;α-SMA,α-平滑肌肌动蛋白;酶联免疫吸附试验。
<b>图5:</b>
图5:。
移植的人iMSCs成功植入Gunn大鼠肝脏并表达肝细胞标记物。iMSC移植后2个月,对大鼠肝组织和血清进行分析。(A)人类的存在资产负债表用qPCR分析Gunn大鼠肝脏内的转录物。其他肝细胞相关基因,如(B) UGT1A1型,(C) HNF4α,(D) BSEP公司,(E) NTCP公司,(F) MRP2型,(G) 密码1a2,(H) CYP2D6/7年,(一) CYP3A4/5/7年、和(J) 法新社通过qPCR的人特异性引物发现。将结果标准化为人类肝脏样本,设定为100%。因此,条形图代表了人类肝脏表达值的比例。(K)人类特异性引物HPRT1型用于评估来自iMSCs的人类细胞的总丰度。(左)MSC标记CD105型在宿主耿氏大鼠肝脏内的qPCR中仍能被人特异性引物检测到。(百万)用蛋白芯片检测移植人iMSCs的Gunn大鼠血清中的人RANTES和SERPINE1。显示了对照组和一个移植组的代表性印迹。中的三个点对代表蛋白质阵列质量控制。密度分析(N)RANTES和(O)SERPINE1斑点(突出显示为红色方框). 控制组的小条表示背景像素密度(像素密度占控制点的百分比)。(A–I,K–L:控制n个 = 4,ESC-iMSC,第10段,n个 = 3;iPSC-iMSC,第10段,n个 = 没有显著差异的组共享相似的字母;P(P) < 0.05).法新社,α-甲胎蛋白;BSEP公司、胆盐出口泵;HNF4α,肝细胞核因子4α;MRP2型多药耐药蛋白2;NTCP公司,Na/牛磺胆酸盐协同转运多肽;定量实时聚合酶链反应;Ugt1A1型,尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶-1a1。
<b>图6</b>
图6。
Gunn大鼠肝脏内人iMSC衍生肝细胞的组织学分析。用DAB染色法对大鼠肝组织进行人细胞质蛋白Stem121免疫组织化学分析(棕色的)iMSC移植后2个月。PHX后2个月对照Gunn大鼠的肝脏切片显示没有特异性Stem121抗体结合,而人类肝组织显示强烈的Stem121-DAB染色,表明其对人类细胞的特异性(A)具有插入;n个 = 4)Stem121 DAB染色也与肝细胞标记物CK18或HNF4α的免疫荧光相结合(黄色的). 干细胞121染色阳性的人iMSC衍生肝细胞在移植后被发现(B–E3)ESC iMSC和(一层至三层)iPSC-iMSC(传代10,n个 = 3). Stem121和CK18或HNF4α的存在证实了人类源性肝细胞的存在。比例尺指示50微米(C–F3)和200微米(A、B)DAB,二氨基联苯胺;肝部分切除术。

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工具书类

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