Ghrelin protects the myocardium with hypoxia/reoxygenation treatment through upregulating the expression of growth hormone, growth hormone secretagogue receptor and insulin-like growth factor-1, and promoting the phosphorylation of protein kinase B

doi:10.3892/ijmm.2018.3886

.2018年12月；42(6):3037-3046.

doi:10.3892/ijmm.2018.3886。 Epub 2018年9月18日。

Ghrelin通过上调生长激素、生长激素促分泌受体和胰岛素样生长因子-1的表达，促进蛋白激酶B的磷酸化，在缺氧/复氧治疗中保护心肌

杨柳¹, 刘燕玲², 李国林³, 陈正荣⁴, 顾贵雄⁵

附属公司

¹中国江苏省苏州市苏州市苏州大学儿童医院儿童卫生科，邮编：215000。
²南昌大学附属第二医院儿科，中国江西南昌330006。
³南昌大学附属第二医院儿科，中国江西南昌330006。
⁴中国江苏省苏州市苏州市苏州大学儿童医院呼吸道疾病科，邮编：215000。
⁵中国江苏省苏州市苏州市苏州大学儿童医院儿童卫生科，邮编：215000。

PMID： 30272367
预防性维修识别码： PMC6202102型
内政部： 10.3892/ijmm.2018.3886

Ghrelin通过上调生长激素、生长激素促分泌受体和胰岛素样生长因子-1的表达，促进蛋白激酶B的磷酸化，在缺氧/复氧治疗中保护心肌

杨柳等。国际分子医学杂志. 2018年12月.

.2018年12月；42(6):3037-3046.

doi:10.3892/ijmm.2018.3886。 Epub 2018年9月18日。

作者

杨柳¹, 刘艳玲², 李国林³, 陈正荣⁴, 顾贵雄⁵

附属公司

¹中国江苏省苏州市苏州市苏州大学儿童医院儿童卫生科，邮编：215000。
²南昌大学附属第二医院儿科，中国江西南昌330006。
³南昌大学附属第二医院儿科，中国江西南昌330006。
⁴中国江苏省苏州市苏州市苏州大学儿童医院呼吸道疾病科，邮编：215000。
⁵中国江苏省苏州市苏州市苏州大学儿童医院儿童卫生科，邮编：215000。

PMID： 30272367
预防性维修识别码： PMC6202102型
内政部： 10.3892/ijmm.2018.3886

摘要

Ghrelin是生长激素（GH）促分泌受体（GHSR）的内源性配体，具有多种生物效应，包括心脏保护。本研究旨在揭示ghrelin对缺氧/复氧（H/R）治疗心肌的积极作用及其相关分子机制。通过聚合酶链反应（PCR）验证，成功构建慢病毒表达载体（ghrelin‑pLVX‑Puro）。分离原代大鼠心肌细胞并用免疫荧光染色鉴定。α‑肌动蛋白的红色荧光的存在表明分离成功。在ghrelin转染和H/R处理后，将原代细胞分为四组：对照组、H/R组、空（空pLVX‑Puro+H/R）和ghrelin（ghrelin‑pLVX−Puro+H/R。分别通过细胞计数试剂盒‑8（CCK‑8）和Hoechst染色评估细胞活力和凋亡。ghrelin组的细胞存活率显著高于空白对照组（P<0.05）。ghrelin组细胞凋亡率显著低于空白对照组（P<0.05）。建立离体大鼠心脏灌注模型。在ghrelin孵育和H/R治疗后，将离体心肌分为四组：对照组、假手术组、H/R组和ghrelin（ghrelin+H/R）组。免疫组织化学分析表明，ghrelin增加心肌细胞的完整性，减少收缩和凋亡。通过逆转录聚合酶链反应（RT）‑PCR、western blot分析和免疫组织化学分析测定GH、GHSR、胰岛素样生长因子‑1（IGF‑1）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p‑Akt。Ghrelin通过H/R治疗上调了GH、GHSR和IGF‑1的mRNA和蛋白表达水平，并增加了心肌细胞和心肌组织中p‑Akt与Akt蛋白水平的比值。总之，ghrelin通过上调GH、GHSR和IGF‑1的表达，促进Akt的磷酸化，保护H/R治疗的心肌。这将为ghrelin治疗缺氧性心肌损伤提供有希望的见解。

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图1
ghrelin及其表达载体的电泳图谱。（A） ghrelin-pUC57质粒酶消化产物的电泳图谱。将ghrelin-pUC57质粒与巴姆HI和生态里。1，ghrelin-pUC57；2-4，ghrelin-pUC57/生态RI公司/巴姆你好。（B）菌落PCR产物的电泳图谱。将从ghrelin-pUC57质粒中分离出的ghrelin连接到pLVX-Puro载体，并通过PCR验证包含ghrelin-pLVX-Puro载体的两个单菌落。1-2，ghrelin-pLVX-Puro；3，pLVX-Puro；聚合酶链反应。

图2
初生新生大鼠心肌细胞的免疫荧光染色。红色和蓝色荧光分别代表α-肌动蛋白和细胞核。

图3
治疗后24、48和72 H，各组[对照组、H/R组、空组（空pLVX-Puro质粒+H/R）和ghrelin组（ghrelin-pLVX-Puroplasm+H/R）]初生大鼠心肌细胞的存活率（如有），通过细胞计数Kit-8分析进行检查。^*与对照组相比P<0.05；^#与空白组相比，P<0.05。H/R，缺氧/复氧。

图4
通过Hoechst染色评估不同组[对照组、H/R组、空组（空pLVX-Puro质粒+H/R）和ghrelin组（ghrelin-pLVX-Puroplasm+H/R）]中初生大鼠心肌细胞的凋亡。^*与对照组相比P<0.05；^#与空白组相比，P<0.05。H/R，缺氧/复氧。

图5
各组原代心肌细胞GH、GHSR、IGF-1、Akt和p-Akt的表达水平。（A）通过逆转录聚合酶链反应测定各组[对照组、H/R组、空（空pLVX-Puro质粒+H/R）和ghrelin（ghrelin-pLVX-Pura质粒+H/R）]原代心肌细胞中GH、GHSR、IGF-1和Akt的mRNA表达水平。（B） western blot分析评价各组原代心肌细胞GH、GHSR、IGF-1、Akt和p-Akt蛋白表达水平。生长激素；生长激素促分泌受体；胰岛素样生长因子-1；蛋白激酶B；p-Akt，磷酸化Akt。^*与对照组相比P<0.05；^#与空白组相比P＜0.05。H/R，缺氧/复氧。

图6
（A）通过逆转录聚合酶链反应测定各组[对照组、假手术组、H/R和ghrelin（ghrelin+H/R）]心肌组织中GH、GHSR、IGF-1和Akt的mRNA表达水平。（B） western blot分析评价各组心肌组织GH、GHSR、IGF-1、Akt和p-Akt蛋白表达水平。生长激素；生长激素促分泌受体；胰岛素样生长因子-1；蛋白激酶B；p-Akt，磷酸化Akt；H/R，缺氧/复氧。^*与对照组相比P<0.05；^#与H/R组相比，P<0.05。

图7
各组心肌组织GH、GHSR、IGF-1和Akt的免疫组化染色图像[对照组、假手术组、H/R和ghrelin（ghrelin+H/R）]。相应的蛋白质和细胞核分别显示为棕色（箭头）和蓝紫色。生长激素；生长激素促分泌受体；胰岛素样生长因子-1；蛋白激酶B；H/R，缺氧/复氧。放大倍数，×200。

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