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.2018年10月26日:8:1-14。
doi:10.1016/j.isci.2018.09.007。 Epub 2018年9月13日。

Xist RNA的活细胞成像和功能解剖揭示X染色体失活和活化机制

附属公司

Xist RNA的活细胞成像和功能解剖揭示了X染色体失活和再活化的机制

诺伯特·哈等。 i科学. .

摘要

我们对X染色体失活关键的原型长非编码RNA Xist(失活X染色体特异性转录物)进行双重标记,使用Pumilio蛋白的可编程RNA序列结合域,一个标记用于活细胞成像,另一个替换a-repeat(Xist的关键域)生成“Δa突变体”以及系链效应蛋白以用于解剖Xist功能。根据在活细胞中观察到的未分化胚胎干(ES)细胞中诱导的XCI被固有X染色体重新激活(XCR)抵消的现象,我们确定果蝇剂量补偿蛋白的同源物Kat8和Msl2是哺乳动物XCR的参与者。此外,活细胞成像显示ΔA Xist云信号明显偏小,澄清了之前RNA荧光原位杂交结果的问题。将候选蛋白标记到ΔA突变体上揭示了Ythdc1、Ezh2和SPOC(Spen)在Xist介导的基因沉默中的重要作用,以及Ezh2在XistRNA传播中的重要角色。

关键词:细胞生物学;发育生物学;遗传学;分子生物学。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
实验系统和诱导西斯特细胞系(A)iXist细胞系和诱导物的方案西斯特等位基因。TRE,四环素反应元件;ΔNeo,无起始密码子的新霉素耐药基因编码区;pPGK-ATG:PGK启动子和起始密码子。(B) 活细胞成像系统和不同工程诱导物的示意图西斯特本研究中使用的等位基因。PUF,Pumilio同源结构域;PBS:PUF结合位点。(C) RNA FISH验证活细胞标记西斯特RNA FISH探针是Cy3标记的(红色)。DNA用DAPI(蓝色)复染。细胞通过Airyscan超分辨率共焦显微镜(卡尔蔡司)以高分辨率成像。所示图像来自单个Z截面。注:虽然Cy3和td番茄的发射光谱重叠,但西斯特RNA FISH信号被清楚地检测到。这可能是由于RNA FISH信号强度和/或西斯特-tdTomato报告基因的介导沉默。比例尺:5μm。另请参见图S1。
图2
图2
未分化ES细胞“日出”的困难(A)西斯特用dox处理活细胞2小时后的信号。(B和C)西斯特未分化ES细胞和分化ES细胞中的RNA信号。除非明确提及,否则所有活细胞成像均在2小时内进行,时间间隔为2分钟。用于两者之间的直接比较Xist公司信号、图像在66分钟的时间跨度内以6分钟的时间间隔显示。首次检测到信号的时间点被定义为信号的时间零点。显示了最大强度z投影。箭头指向锡斯特云。(D) 增长曲线西斯特RNA信号。的测量西斯特RNA信号大小随时间增加。首次检测到信号时,信号的大小(面积)被定义为信号的“大小1”。西斯特从每个样本中随机选择20个细胞,分析RNA信号。数据显示为带趋势线的平均值±SEM。(E) “星”和“花”的生长曲线西斯特多西环素治疗后未分化ES细胞中RNA信号的出现。另请参见图S2和视频S2、S3和S4。
图3
图3
诱导XCI和内在XCR(A)之间的“拔河”定量RT-PCR结果显示西斯特-未分化细胞和分化细胞之间X连锁基因的介导沉默效应。多西环素治疗24小时。结果显示为相对折叠表达式。使用Actb公司Gapdh公司未分化细胞中每个基因的表达水平设为1。误差条表示SEM(n=3)。使用的统计分析是Student的t吨测试。p值在每个基因的一对数据集之间进行计算。*p<0.05。(B和C)(B)多西环素诱导iXist细胞死亡试验。细胞培养为未分化或分化的ES细胞。多西环素治疗4天。(C) 通过测量结晶紫染色面积计算分化细胞的细胞存活率。通过碱性磷酸酶染色菌落计数计算未分化细胞的细胞存活率。数据显示为生物三倍体的平均值±SEM。使用的统计分析是Student的t吨测试。*p<0.05。(D) 免疫核糖核酸FISH检测Nanog和西斯特用dox处理未分化iXist细胞3小时。DNA用DAPI(蓝色)复染。细胞在不含2i的传统含Lif的ES培养基中培养。与讨论相关的图像中的细胞核标记为#1–6。RNA FISH探针为Cy3标记(红色)。白色箭头表示三个西斯特在3~5号核中检测到云信号。通过免疫染色(绿色)检测Nanog。ImageJ使用选定的信号强度阈值识别Nanog-high和Nanog-low细胞。1号核和2号核是纳米级的,因为整个核或其大部分被识别为单个“粒子”(突出显示周长的黄色轮廓),高于选定的信号强度阈值。根据数据分析仪的主观性,6号细胞核可分为纳米高细胞或未确定细胞。细胞核#3–5属于Nanog-low细胞。(E) XCI和XCR的反作用力决定了在dox诱导下未分化iXist细胞中的X失活状态。(F) Xist公司脱去强力霉素后RNA信号消失。另请参见图S3–S5。
图4
图4
组蛋白乙酰转移酶Kat8蛋白复合物在XCR(A和B)(A)多西环素诱导不同诱导物细胞死亡实验中的推测作用西斯特细胞系。细胞培养为未分化的ES细胞。多西环素治疗4天。(B) 通过碱性磷酸酶染色菌落计数计算细胞存活率。数据显示为生物一式三份的平均值±SEM。使用的统计分析是Student的t吨测试。*p<0.05。(C) 增长曲线西斯特RNA信号。首次检测到信号时,信号的大小(面积)被定义为信号的“大小1”。西斯特从每个样本中随机选择20个细胞,分析RNA信号。数据显示为带趋势线的平均值±SEM。(D)西斯特用dox处理2小时的活细胞中的信号。的代表性图像西斯特2小时dox处理后活细胞中的RNA信号显示为最大强度z投影。比例尺,5μM。(E) 西斯特脱去强力霉素后RNA信号消失。将细胞培养为未分化的ES细胞,在去除dox前用dox处理过夜(每个时间点的样品n>175)。另请参见图S6–S8。
图5
图5
ΔA突变体的小尺寸Xist公司云(A)的代表性图像西斯特活细胞中的RNA信号。图像显示为最大强度z投影。(B和C)(B)西斯特云大小测量(每个数据集的n≥50)。细胞培养为分化的ES细胞。多西环素治疗24小时。(C) 统计分析(学生t吨测试)以比较西斯特实验面板内所有样本对之间的云大小。p大于0.05的值用红色标记。另请参见图S9。
图6
图6
Ezh2的人工系留恢复了ΔA突变体上衰减的PRC活性西斯特RNA(A)诱导物的功能验证西斯特强力霉素诱导细胞死亡的等位基因。将细胞培养为未分化的ES细胞。多西环素治疗5天。通过碱性磷酸酶染色测量面积计算细胞存活率。数据显示为生物三倍体的平均值±SEM。使用的统计分析是Student的t吨测试。将ΔA突变体的细胞存活率与其他4个样本进行比较。*p<0.05。(B) 免疫-RNA FISH检测H3K27me3、H2AK119ub和西斯特在分化后的细胞中,用dox处理48小时。在RNA FISH之前进行免疫染色。DNA用DAPI复染。数据显示为生物三倍体的平均值±SD(每个样品的n=63–153)。比例尺,5μM。另请参见图S10和S11。

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