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.2018年9月12日9:2096。
doi:10.3389/fimmu.2018.02096。 2018年eCollection。

通过MAVS-TRAF6-Beclin-1信号轴激活RIG-I介导的抗病毒信号触发自噬

纳雷·李 1, Junsu Ban公司 1, Noh-Jin Lee公司 1, 蔡敏毅 1, Ji-Yoon Choi先生 1, 金贤斌（Hyunbin Kim） 2 三, 李钟基 1, Jihye Seong先生 2 三, Nam-Hyuk Cho公司 4 5, Jae U Jung先生 6, 京秀酒店 1 2
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通过MAVS-TRAF6-Beclin-1信号轴激活RIG-I介导的抗病毒信号触发自噬

纳雷·李等人。 前部免疫. .

摘要

自噬与抵抗各种细胞内病原体的先天免疫反应有关。最近的研究报告称，病原体识别传感器（包括Toll样受体和环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸合成酶）可以触发自噬，从而参与先天免疫。在本研究中，我们检测了通过识别病毒RNA来检测病毒感染的RIG-I信号通路是否触发了自噬过程。将polyI:C引入细胞质，或仙台病毒感染，在正常细胞中显著诱导自噬，但在缺乏RIG-I的细胞中没有。PolyI:C转染或仙台病毒感染在缺乏I型干扰素信号的细胞中诱导自噬。这表明这种影响不是由干扰素信号引起的。RIG-I介导的自噬因线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）或肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6的缺乏而减弱，表明RIG-I-MAVS-TRAF6信号轴对RIG-1介导的自噬至关重要。我们还发现Beclin-1转位到线粒体，在RIG-I激活时与TRAF6相互作用。此外，Beclin-1在RIG-I激活后经历K63多泛素化，TRAF6缺陷细胞的泛素化降低。这表明RIG-I-MAVS-TRAF6轴诱导Beclin-1的K63连锁多泛素化，这与触发自噬有关。由于自噬缺陷增加了I型干扰素反应，RIG-I途径诱导的自噬也可能有助于防止干扰素过度反应作为一种负反馈机制。

关键词：贝克林-1；MAVS；钻机-I；TRAF6；自噬；先天免疫；多泛素化。

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数字

图1
图1
RIG-I激活激活自噬。（A）用polyI:C（2μg）转染HEK293T细胞或感染仙台病毒（SeV）（200 HA U/mL）达指定时间。使用LC3（LC3-I和LC3-II）、磷酸化IRF3（p-IRF3）和β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞裂解产物。（B）HEK293T细胞转染polyI:C或感染SeV（A）并孵育12 h。用cytoID-绿色试剂标记自噬体，并用荧光显微镜观察。底部面板显示用赫斯特染料染色以显示细胞核。（C）用polyI:C（10μg）转染HEK293T细胞或用SeV（200 HA U/mL）感染HEK293细胞12 h。收集、固定细胞，并进行透射电镜观察自噬小泡（下部面板中的红色箭头）。底部面板显示了顶部面板中装箱区域的放大视图。下图显示了由5幅不同图像确定的细胞自噬空泡的平均值。数据以平均值±SE表示。（D）模拟处理HEK293T细胞，用polyI:C转染或感染SeV（A）洗涤固定后，用抗LC3抗体和FITC-标记的二级抗体染色，观察LC3斑点，并用荧光显微镜观察。使用image J软件对穿孔数进行统计和分析。底部面板显示一个单元格中LC3点的平均数。数据表示为平均值±SE。（E）用polyI:C转染HEK293T细胞或感染SeV，并用或不用巴非霉素（50 nM）处理指定小时。使用LC3和β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞裂解产物。LC3II/I的比值通过密度测定法测定，如下所示。（F）用polyI:C（2μg）转染HEK293T细胞或感染SeV（200 HAU/mL），并用环己酰亚胺（CHX，100 ng/mL）处理指定小时。免疫印迹法分析p62水平。每个实验重复三次或更多次，并显示了具有代表性的数据。底部面板显示相对的p62表达水平。数据表示为未处理样品（灰色条）和polyI:C转染或SeV感染样品（黑色条）的平均±SE。值为*对< 0.05, **对< 0.005. 与未处理的样品相比。
图2
图2
RIG-I在不同类型细胞中诱导自噬。（A）用polyI:C（2μg）转染Raw264.7小鼠巨噬细胞，转染时间为指定的小时。使用LC3、磷酸化IRF3和β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析细胞裂解产物。（B）模拟处理Raw264.7细胞，转染polyI:C（2μg），感染SeV（200 HAU/ml）或RIG-IN（100ng）8h。洗涤固定后，用抗LC3抗体和FITC-标记的二级抗体染色，观察LC3点，并用荧光显微镜观察。（C）用polyI:C（2μg）转染N2a小鼠下丘脑细胞或感染仙台病毒（SeV）0、4或8 h。用所示抗体作为主要抗体，通过免疫印迹分析细胞裂解物。（D）用polyI:C转染BV-2小鼠小胶质细胞，并孵育指定小时。使用指示的抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物。每个实验重复三次或三次以上，并显示了代表性数据。（E）对照组（pGIPZ）或Beclin-1敲除组（BECN-KD）A549细胞转染polyI:C（上部）或RIG-IN（下部），并培养指定小时。用RT-qPCR分析IFN-β和ISG15的mRNA水平。（F）用polyI:C（上部）或RIG-IN（下部）转染Atg3野生型（Atg3 WT）或Atg3敲除（Atg3KO）MEF。用RT-qPCR分析IFN-β和ISG15的mRNA水平。数据表示为平均值±SE**对< 0.005. ***对< 0.0005.
图3
图3
RIG-I的组成型活性形式触发自噬。（A）用组成活性的RIG-I（RIG-IN）或MDA5（MDA5-N）N末端卡结构域转染HEK293T细胞。使用抗LC3和抗β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹法分析LC3的脂化作用。（B）用载体或RIG-IN转染HEK293T细胞，孵育24 h。用细胞免疫试剂对自噬体进行染色，并在荧光显微镜下观察。底部面板显示用赫斯特染料染色以显示细胞核。（C）用RIG-IN或MDA5-N转染HEK293A细胞。转染后18小时，细胞固定，用抗LC3抗体和FITC-标记的二级抗体染色，并进行荧光显微镜观察。使用image J软件对穿孔数进行统计和分析。右侧面板显示一个单元格中LC3点的平均数。数据表示为平均值±标准误差。（D）用RIG-IN转染HEK293T细胞0、6、9、12和24小时。通过免疫印迹分析p62水平。使用独立实验的3个结果进行密度分析**对< 0.005. 与0小时对照。（E）HEK293T细胞在收获前用载体或RIG-IN转染0或24小时，加或不加氯喹（CQ）处理（20μM）12小时。使用抗LC3抗体对细胞进行免疫印迹。（F）用2μg polyI:C转染I型干扰素受体（INFR）缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞，并孵育0、4或8小时。通过免疫印迹分析LC3脂质化。（G）用2μg polyI:C转染Vero细胞或用200 HA U/mL SeV感染0、4或8小时。通过免疫印迹分析LC3脂质化。每个实验重复三次或更多次，并显示了具有代表性的数据。
图4
图4
功能性RIG-I是polyI:C和仙台病毒（SeV）介导的自噬激活所必需的。（A）用2μg polyI:C转染具有缺陷RIG-I活性的Huh7人肝癌细胞和Huh7-衍生Huh7.5细胞。使用抗LC3和抗β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析LC3脂质过氧化。（B）如图所示，Huh7和Huh7.5细胞感染了A型PR8流感（Flu-PR8）（感染多重性=1）。LC3脂质化分析如下（A）转染2μg polyI:C的野生型（WT）和RIG-I敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞中的LC3脂质氧化（C）或感染200 HA U/mL SeV（D）LC3脂质化分析如下（A）每个实验被重复三次或更多次，并且显示了代表性数据。
图5
图5
线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是诱导自噬所必需的。（A）用MAVS转染HEK293T细胞，并在0、6和12小时后收获细胞。使用抗LC3抗体通过免疫印迹分析LC3脂质过氧化。（B）用2μg polyI:C转染野生型（WT）和MAVS敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），转染时间分别为0、4或8小时（A）.（C）用10μg polyI:C转染WT和MAVS KO MEF 12 h。透射电镜观察细胞。底部面板显示了顶部面板中装箱区域的放大视图。底部的图表显示，细胞中存在自噬液泡。数据表示为平均值±SE。（D）用200 HA U/mL SeV感染WT和MAVS KO MEF，并用环己酰亚胺（CHX，100 ng/mL）处理0、6或12 h。用免疫印迹法分析p62水平。每个实验重复三次或三次以上，并显示了代表性数据。
图6
图6
肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6是诱导自噬所必需的。用2μg polyI:C转染WT和TRAF6 KO MEF（A）或感染200 HA U/mL SeV（B）在0、4或8小时内，使用抗LC3抗体通过免疫印迹法分析LC3脂质过氧化。（C）用polyI:C（2μg/孔）或RIG-IN（100 ng/孔）转染TRAF6 WT和KO MEF。转染18小时后，用抗LC3抗体和FITC-标记的二级抗体染色观察LC3-bunta。使用image J软件对穿孔数进行统计和分析。右侧面板显示一个单元格中LC3点的平均数。数据表示为平均值±平均值标准误差。（D）用200 HA U/mL SeV感染WT和TRAF6 KO MEF，并用CHX（100 ng/mL）处理0、6或12 h，然后使用抗p62抗体进行免疫印迹。每个实验重复三次或更多次，并显示了具有代表性的数据。
图7
图7
RIG-I的激活增加了肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6和Beclin-1之间的相互作用。（A）用Flag-Beclin-1（Flag-BECN1）和pEBG（GST，-）或pEBG-RIG-IN（RIG-IN，+）转染HEK293T细胞。转染后36小时，用M2抗标记抗体涂层树脂对细胞裂解物进行联合免疫沉淀（co-IP）。sepharose树脂（Sep）作为阴性对照。使用所示抗体通过免疫印迹法分析全细胞裂解物（WCL）和来自co-IP的样品。（B）用V5-Beclin-1转染HEK293T细胞。转染12小时后，在不同的时间点将polyI:C转染到细胞中，并培养指定的小时。使用抗V5抗体对细胞裂解物进行co-IP，然后使用所示抗体进行免疫印迹。（C）用polyI:C转染HEK293T细胞，并在0、0.5、1、2、4和6 h收获。将细胞裂解物与抗Beclin-1（BECN1）抗体进行co-IP，并使用所示抗体进行免疫印迹分析。（D）用Flag-BECN1、pEBG（GST）或pEBG-RIG-IN转染HEK293T细胞并孵育24小时。按照材料和方法中的描述分离线粒体和细胞质部分，并使用指示的抗体进行免疫印迹。（E）用GST控制载体或GST-RIG-IN和V5-Belin-1转染HEK293A细胞。转染后18小时，用Mitotracker和抗V5抗体对细胞进行染色，如材料和方法中所述。通过共焦显微镜观察固定皿。右侧面板显示了Mitotracker（红色）和Beclin-1（绿色）沿着左侧面板图像的白线的强度。（F）用V5-Beclin-1转染HEK293A细胞。转染16小时后，细胞被模拟感染或SeV感染4小时。Beclin-1的定位通过共焦显微镜进行分析，如（E）每个实验重复三次或三次以上，并显示了具有代表性的数据。
图8
图8
RIG-I激活增加Beclin-1的K63连接多泛素化。（A）用Flag-Beclin-1（Flag-BECN1）和pEBG（GST）或pEBG RIG IN转染HEK293T细胞，并孵育24小时。使用M2抗Flag树脂对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并使用所示抗体通过免疫印迹进行分析。（B）用Flag-BECN1和pEBG-RIG-IN转染HEK293T细胞，并用或不用20μM氯喹（CQ）处理。细胞裂解物通过IP和免疫印迹进行分析，如（A）.（C）用所示质粒转染HEK293T细胞，并在20μM CQ存在或不存在的情况下培养12 h。用IP和免疫印迹法分析Beclin-1的Lys63（K63）连接多泛素化。（D）用Flag-Beclin-1转染HEK293T细胞。24 h后，用polyI:C转染细胞并孵育0、0.5、1、2、4和6 h。通过IP和免疫印迹分析细胞裂解物。（E）用V5-Beclin-1和HA-K63泛素突变质粒转染HEK293T细胞。24小时后，用polyI:C转染细胞并孵育0、3或6小时。细胞裂解物通过IP和免疫印迹分析。（F）用polyI:C转染HEK293T细胞并孵育0、2、4和8 h。细胞裂解物用抗Beclin-1（BECN1）抗体进行IP处理并通过免疫印迹分析。（G）用Flag-BECN1转染野生型（WT）和TRAF6敲除（TRAF6 KO）MEF。24小时后，用SeV感染细胞并孵育0、4或8小时。细胞裂解物进行IP和免疫印迹。每个实验重复三次或更多次，并显示了具有代表性的数据。
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