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.2018年9月25日；9(1):3922.
doi:10.1038/s41467-018-06176-3。

单细胞分辨率下小鼠胰腺发育的谱系动力学

劳伦·拜恩斯 1, 丹尼尔·M·王 1, Meena Subramaniam公司 2, 纳撒尼尔·P·迈耶 1, 卡罗琳·吉尔克里斯特 1, 莎拉·M·诺克斯 3, 亚伦·D·特沃德 4, Chun J Ye先生 2, 朱莉·B·斯奈登 5
附属公司

单细胞分辨率下小鼠胰腺发育的谱系动力学

劳伦·拜恩斯等。 国家公社. .

摘要

器官发生需要多个细胞谱系的复杂相互作用，这些细胞谱系随着时间的推移协调其扩展、分化和成熟。在这里，我们使用单细胞RNA测序、免疫荧光、原位杂交和遗传谱系追踪的组合，对小鼠胰腺上皮和间充质区室在整个发育时间内的细胞类型进行了分析。我们确定了先前未被充分认识的发育中间充质的细胞异质性，并重建了胰腺间皮和间充质细胞类型之间的潜在谱系关系。在上皮内，我们发现以前未描述的内分泌祖细胞群，以及人类胎儿组织和人类胚胎干细胞中分化为胰岛β细胞命运的类似群体。此外，我们沿着该人群向α或β细胞谱系分化的轨迹确定候选转录调控因子。这项工作确立了胰腺发育的路线图，并证明了这种方法在理解发育器官的谱系动力学方面的广泛应用。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
单细胞测序确定E14.5小鼠胰腺中广泛的细胞异质性模式。一小鼠胰腺发育概述。b条实验方法示意图。c（c）混合E14.5小鼠胰脏中种群的t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）可视化(n个 = 14） 。每个点代表单个细胞的转录组，根据其细胞特性（上皮细胞、间充质细胞或免疫/血管细胞）进行彩色编码。每个细胞室包含多个亚群，由不同程度的色差表示。d日已建立的标记基因可识别上皮细胞（Cdh1+）、内分泌细胞（Chga+）、间充质细胞（Vim+和Col3a1+），内皮细胞（Pecam1+）和免疫细胞（Rac2+）。e（电子）热图显示，与所有其他集群相比，每个集群中差异表达的基因超过两倍。细胞以列表示，基因以行表示。用于注释簇的特定基因显示在热图的右侧
图2
图2
多个无特征间充质细胞群体的鉴定。一亚簇E14.5间充质簇的t-SNE可视化（来自n个 = 14胰腺）。b条基于每个集群中的平均基因表达，绘制上皮和间充质种群中皮尔逊相关值的密度图（如补充图3b中的热图所示）。c（c）每个间充质细胞群体顶部差异表达标记的点图。条形图由中的簇标识进行颜色编码一.灰色条表示泛间充质标记。每个点的大小代表了特定群体中表达该基因的细胞的比例；颜色的强度表示表达的平均水平。d日簇1、簇2、簇4和簇5中细胞差异表达大于2倍的基因的路径分析。e（电子）标记簇1的基因的表达(洞穴1), 2 (标准2), 4 (Cxcl12号机组)、和5(条形图1)在所有E14.5间充质细胞中。颜色强度表示表达水平。（f）–小时多重荧光原位杂交结合Epcam IF验证簇2和5(（f）)和集群1(g-h（克-小时）). Epcam标记胰腺上皮。在(（f）)，棒材1 + 单元格（红色箭头，簇5）不同于Stmn2+单元格（绿色箭头，簇2），验证单个单元格数据。在(克)，Cav1+细胞（红色箭头，簇1）与Stmn2+细胞（绿色箭头，簇2）不同。在(小时)，Barx1+细胞不表达洞穴1（红色箭头）表示集群5，而Barx1+/Cav1+单元（黄色箭头）表示群集1。不表达Cav1+细胞条形图1（绿色箭头），可能代表内皮细胞。比例尺代表50 µm英寸f–h
图3
图3
间皮细胞在发育过程中是动态的，预计会产生血管平滑肌。一E12.5融合间充质簇的t-SNE可视化(n个 = 18胰腺），E14.5(n个 = 第1批14个胰腺；n个 = 第2批为11）和E17.5(n个 = 8胰腺）组织。在每个时间点确定间充质簇，将其分簇、合并并重新分析。单元格按簇或时间点着色。圆点突出显示时间点分隔的间皮簇。b条时间点特定间皮簇（簇1、簇11和簇17）中顶部差异表达基因的点图。点的大小表示表示每个指定标记的人口比例。颜色表示表达级别。c（c）ISH用于坑x2和Msln女士在E12.5和E17.5胰腺中。坑x2在E12.5中检测到表达，但在E17.5间皮中检测不到表达，而Msln女士在E17.5中检测到，但在E12.5间皮中未检测到。波形蛋白（Vim）IF染色显示胰腺间质。虚线表示组织边界。黄色箭头表示Pitx2+间皮细胞。红色箭头表示Msln+间皮细胞。比例尺代表50 微米。d日合并间充质簇中VSM相关基因的表达水平。颜色强度表示表达水平。e（电子）间皮细胞和VSM相关融合的间充质簇的伪时间排序。颜色对应于中的t-SNE一所有簇在补充图3j中单独绘制。（f）伪时间上的簇比例。将伪时间分为十组，并计算每个簇在该伪时间范围内的比例。克基于伪时间排序的间皮和VSM相关间充质细胞群体间的谱系关系模型e（电子）
图4
图4
E14.5小鼠胰腺上皮细胞群的鉴定。一t-SNE仅显示上皮组，如图1所示。b条描绘上皮细胞群已知和无特征标记以及Fev特异标记的点图您好!人口。点的大小表示表示每个指定标记的人口比例。颜色表示表达级别。c（c）的表达式铁和Ngn3号机组上皮细胞内。颜色表示表达级别。d日Ngn3+和Fev的基因表达比较您好!人口。差异表达大于2倍的基因以深蓝色突出显示（Fev含量较高您好!细胞）或淡蓝色（Ngn3+细胞较高）。e（电子）Ngn3+和Fev中差异表达大于2倍的基因的通路分析您好!人口。（f）内分泌谱系（Ngn3+，Fev）661细胞的t-SNE可视化您好!、α、β和ε种群）。克Ngn3+，Fev+/Pax4+，Fev的伪时间排序您好!α和β细胞群将Fev+细胞置于Ngn3+和激素+细胞群之间
图5
图5
铁您好!细胞是内分泌祖细胞。一原位杂交（ISH）Ngn3号机组,铁，以及岛屿1在血统追踪中Ngn3-Cre；罗莎26毫微克E14.5胰腺，其中Ngn3号机组-血统追踪细胞为mGFP+。灰色箭头标识Ngn3号机组+细胞，可能还没有Ngn3谱系标记，因为Ngn3号机组表达和允许mGFP表达的Cre介导的重组的延迟。蓝色箭头标识Ngn3号机组+/铁+Ngn3谱系追踪的细胞。黄色箭头标识Ngn3号机组-血统追踪细胞铁+，但不表示Ngn3号机组或岛屿1.紫色箭头标识铁+/岛屿1+Ngn3谱系追踪的细胞。洋红色箭头标识岛屿1+Ngn3谱系追踪的细胞。b条–c（c）双ISH/免疫荧光（IF）天然气N3和FEV公司妊娠23周人胎儿胰腺中mRNA和CHGA蛋白的表达(n个 = 1胰腺）。灰色箭头标识下一代网络3+单元格。黄色箭头标识FEV公司+单元格。紫色箭头标识FEV公司+/CHGA+细胞。洋红色箭头表示CHGA+单元。d日多路荧光ISH天然气N3,FEV公司，以及ISL1系统hESC衍生内分泌祖细胞中的mRNA。蓝色箭头标识天然气N3+/FEV公司+细胞。黄色箭头标识FEV公司+单元格。紫色箭头标识FEV公司+/ISL1系统+单元格。e（电子）对检测到的每个人群进行量化Ngn3号机组-谱系追踪胰腺占Ngn3号机组-谱系追踪细胞(n个 = 464个细胞，6个胰腺）。数据以平均值表示 + 标准偏差（SD）。（f）在人胚胎干细胞源性祖细胞中检测到的每个群体的数量占总染色细胞的百分比(n个 = 418个细胞，3个集群代表来自一个人类胚胎干细胞分化的技术复制）。数据以平均值表示 + 标准偏差。克Fev推导的建议模型您好!Ngn3+细胞的内分泌细胞及其向激素+/Fev的分化Lo（低）内分泌细胞。中箭头和条的颜色一–（f）对应于中的单元标识克.一,d日比例尺：10 微米。b条,c（c）比例尺：20 微米。小时v2合并内分泌时间进程的t-SNE可视化（E12.5，E14.5，聚合E17.5）。聚类基于与v1数据集或顶部差异表达基因的相关性进行注释。我v2的时间点标签合并了内分泌时间进程数据。t-SNE与小时.j每个时间点的单元类型比例，根据小时
图6
图6
分化激素+内分泌细胞通过铁-胰腺发育过程中的表达阶段。一–e（电子）双IF（用于膜GFP）和荧光ISH用于激素Fev-Cre；俄罗斯26毫微克E14.5处的血统追踪动物。n个 = 4个胰腺的46个细胞英寸1（100%标记血统）；n个 = 4个胰腺细胞中的103个Gcg公司（100%谱系标记）；n个 = 2个胰腺的6个细胞上海（100%血统标记）；n个 = 2个胰腺的26个细胞Ghrl/Gcg公司（23.2%有谱系标记）；n个 = 8个胰腺的71个细胞Ppy公司（90.1%的血统标记）。比例尺代表10 微米。（f）E14.5示意图Fev-Cre；俄罗斯26毫微克FACS分类和单细胞RNA测序。克用于单细胞测序的分离胰腺中分选的单个、活GFP+和TdTomato+/GFP−细胞的代表性FACS图。小时内分泌细胞的t-SNE可视化铁-谱系追踪E14.5小鼠胰腺(n个 = 3).我内分泌细胞类型主要标志物的表达。颜色表示表达级别，但电子GFP图，表示存在或不存在电子绿色荧光蛋白计数
图7
图7
确定β和α细胞命运决定的候选调节器。一图6h所示E14.5处内分泌细胞的假时间顺序产生了一个分叉树，其中两个主要分支终止于高度表达英寸1（β细胞分支）或Gcg公司（α细胞分支）。b条以假时间表示每个分支的基因表达的热图。在每个分支的整个伪时间轨迹上计算独立的表达式模式。因此，将分别为每个分支显示分支点之前的轨迹部分。基因基于跨假时间的表达模式进行聚类；右侧突出显示了沿着分支具有差异表达的选定基因。c（c）描述每个分支的动力学趋势的基因表达图。d日–e（电子）多路荧光ISH铁,促性腺激素12，以及岛屿1(d日)或Fev，聚乙二醇10，以及岛屿1(e（电子）)沿袭E14.5Ngn3-Cre；俄罗斯26毫微克胰腺。箭头识别具有血统追踪功能的Fev+/Islet1−细胞Gng12号机组(d日，青色渐变箭头）或聚乙二醇10(e（电子），靛蓝渐变箭头）表达式。（f）多路荧光ISH铁,Gng12号机组，以及英寸1青色箭头识别表达Gng12号机组.克多路荧光ISH铁,聚乙二醇10，以及Gcg公司靛蓝箭头识别谱系追踪的Gcg+α细胞，这些细胞表达聚乙二醇10.小时Fev模型您好!（黄色）细胞分化为不同的α或β细胞。聚乙二醇10和Gng12号机组Fev中的表达您好!细胞可能代表在内分泌谱系分配过程中分别向α和β谱系预先注定的祖细胞。d日–克比例尺代表10 微米。蓝色染色代表DAPI标记的细胞核。箭头的颜色与小时
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