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.2018年10月22日;7(10):生物035287。
doi:10.1242/bio.035287。

李斯特菌溶血素O引起的质膜损伤不能通过膜孔内吞修复

附属公司

李斯特菌溶血素O引起的质膜损伤不能通过膜孔内吞修复

拉尔斯·尼格罗德·斯卡尔曼等。 生理盐水开放. .

摘要

细胞内机制被认为对质膜修复很重要,以应对诸如李斯特菌溶血素O(LLO)等形成孔的毒素,这些毒素会形成膜孔,破坏细胞内稳态。然而,人们对不同的内吞机制在这一过程中的具体作用知之甚少。在这里,我们讨论了关键内吞途径的重要性,并开发了报告系统,用于实时成像LLO孔隙形成的内吞反应。我们发现,氯氰菊酯非依赖性内吞途径的缺失对膜修复效率产生了负面影响。然而,我们没有检测到这些途径的活性增加,也没有检测到与毒素或膜修复标记物共存,这表明它们没有直接参与从质膜上去除LLO孔。事实上,氯氰菊酯非依赖性载体(CLIC)的标记物在钙引起的膜损伤的急性期迅速被分解2+流入,然后在孔隙形成后约2分钟重新组装。我们认为,这些内吞机制可能通过调节质膜组成和张力而影响膜修复,但不是通过LLO孔的直接内化。

关键词:氯菊酯非依赖性内吞作用;CLIC公司;洞穴;氯氰菊酯介导的内吞作用;LLO;李斯特菌溶素;膜损伤;膜孔;修理。

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数字

图1。
图1。
细胞内蛋白对于LLO诱导的质膜损伤的膜修复非常重要。(A) 经过5次处理的HeLa细胞的代表性荧光显微照片培养基中不同浓度(如图所示)的LLO的最小值为1.8mM钙2+(顶部)或带有5mM EGTA(底部)。LLO处理后,用PI孵育细胞,清洗、固定,用DAPI染色并成像。(B) 如图所示,经siRNA处理的HeLa细胞暴露于含有1.8mM氯化钙2带75ng/ml LLO(+LLO)或不含LLO(对照)537°C下,用DAPI和PI染色。(C) 用LLO毒素处理后显示的siRNA处理细胞中荧光显微照片的平均PI强度条形图。数据代表至少三个独立实验。平均相对PI强度值:caveolin1=2.40,clathrin=1.38,GRAF1=2.23,cdc42=2.02。P(P)-Mann-Whitney检验值与siRNA ctrl的比较:caveolin1=0.0001,crathrin=0.003,GRAF1=0.0001cdc42=0.0001。n个=3.误差条代表标准偏差比例尺:25μm。
图2。
图2。
细胞溶质钙增加后,Annexin A6被招募到LLO诱导的损伤部位2+.(A) Fluo-3和ANXA6-mCherry在1fps显示LLO处理后胞浆Fluo-3强度增加(倒置上图)和膜联蛋白A6募集到质膜(白色箭头头下图)。(B) 显示LLO处理细胞和对照细胞质膜突起ROI中细胞溶质Fluo-3和特异性ANXA6-mCherry相对强度的量化图。电影第一帧中每个通道的平均强度设置为1。时间0表示所有子图中的采集开始时间。时间(秒)。(C) 用LLO和FM4-64处理的ANXA6-BFP转染的HeLa Flp-In TRex细胞的活细胞共聚焦旋转盘时间序列。281的时间序列显示了ANXA6-BFP(上三行)和FM4-64(下三行)的。右边的插图显示了白色方块所示区域的放大倍数,并说明FM4-64和Annexin A6染色相似。时间以秒表示。比例尺:10微米。
图3。
图3。
添加LLO后,细胞内蛋白不会被招募到膜联蛋白A6的位点。(A) ANXA6-mCherry结构的活细胞共焦旋转圆盘成像的代表性图像以及不同时间点这些位点的内吞蛋白定位。左侧是时间点0处单元格的概述。电影是在1点拍摄的fps,时间以秒为单位显示。比例尺:2μm。转染ANXA6-mCherry并用LLO处理的TRex细胞中GFP-SNX9、caveolin1-GFP、EHD2-GFP和GRAF1-GFP-Flp-In的活细胞共焦旋转圆盘显微镜。(B) 质膜(PM)、膜联蛋白和内吞组件的示意图,说明了如何绘制测量两个通道强度的截面,以及如何测量和分类荧光强度。这一部分是针对膜联蛋白A6结构处或附近所有可见的内吞结构绘制的。内吞蛋白在ANXA6-mCherry组装体中的定位被量化为:;共定位,近端(如果在1以内μm),通过使用ANXA6-mCherry结构上绘制的线分析GFP和mCherrry的强度,如果没有发现相关性,则距离也很遥远。(C) ANXA6-mCherry结构内吞蛋白定位的定量10ANXA6-mCherry(−10)出现之前s) ,招聘时(0s) 以及10、30和60在招聘之后。对每个内吞蛋白总共40–100个事件进行量化。
图4。
图4。
荧光标记的LLO积累 在突出的棘突中,并且不与内吞标记物共存。(A) 现场共焦旋转圆盘成像的荧光显微照片每帧转染ANXA6-BFP(蓝色)并用LLO-A647(红色)处理的Flp-In TRex细胞。黄色箭头表示点状物中ANXA6-BFP和LLO-A647之间的共同定位。白色双箭头表示与ANXA6-BFP无关的LLO-punctae。比例尺:10μm。(B) 用LLO-A647处理的TRex细胞中GFP-SNX9、caveolin1-GFP和GRAF1-GFP Flp的活细胞共聚焦旋转盘成像的代表性荧光显微照片(见电影68). 比例尺:3μm。(C–D)图示LLO-A647和caveolin1、GRAF1和SNX9之间皮尔逊系数(C)和曼德斯系数(D)随时间变化的分析图,如图所示。在2根据条件分析每帧的s,并指出随时间的平均值。(E) 荧光显微照片时间序列来自活细胞共焦旋转圆盘显微镜,对转染ANXA6-BFP(蓝色)并用LLO-A647(红色)处理的GRAF1-GFP(绿色)Flp-In TRex细胞进行分析。时间(以秒为单位)显示在右上角。比例尺:10μm。下图显示了LLO-A647处理细胞中GRAF1斑点的相对数量和ANXA6-BFP随时间的相对强度(任意单位)。
图5。
图5。
LLO的孔隙形成抑制GRAF1组装,但不影响小窝蛋白1-或SNX9-阳性结构的数量。(A) 显示通过活细胞TIRF显微镜检测到的HeLa Flp-In TRex细胞内吞点数量的图表,这些细胞表达用LLO处理的不同内吞蛋白。TIRF领域中存在的内吞结构数量每3个进行量化s代表5添加LLO之前和之后的min,并绘制为相应电影的第一帧设置为1的点的相对数量。误差条代表标准差。仅对添加LLO后细胞显示ANXA6-mCherry向质膜募集的电影进行量化。时间0s表示所有子图中的采集开始时间。这些数据代表了从几个细胞和三个独立实验的独立电影中得出的定量n个=3,GRAF1除外,其中n个=7个单元格上的1。(B) 显示TRex细胞中表达GFP-GRAF1的固定Flp-In的最大投影共焦z堆的代表性显微照片。车辆DMSO(控制),10μM离子霉素和50将μM Bapta-AM添加到细胞中30min分别进行了固定和成像,如图所示。比例尺10μm。(C) 30后量化的GFP-GRAF1结构数量条形图药物治疗分钟。P(P)-单向方差分析值:对照组与离子霉素P(P)<0.01,对照组vs Bapta AMP(P)<0.0001,离子霉素vs Bapta AMP(P)<0.0001.n个=3.误差线代表s.d。

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引用人

工具书类

    1. Andrews N.W.、Almeida P.E.和Corrotte M.(2014)。损伤控制:质膜修复的细胞机制。趋势细胞生物学。24, 734-742. 2016年10月10日/j.tcb.2014.07.008-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ariotti N.、Fernández-Rojo M.A.、Zhou Y.、Hill M.M.、Rodkey T.L.、Inder K.L.、Tanner L.B.、Wenk M.R.、Hancock J.F.和Parton R.G.(2014)。小泡调节质膜的纳米级组织以远程控制Ras信号。《细胞生物学杂志》。204, 777-792. 10.1083/jcb.201307055-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Atanassoff A.P.、Wolfmeier H.、Schoenauer R.、Hostettler A.、Ring A.、Draeger A.和Babiychuk E.B.(2014)。在链球菌溶血素O诱导的质膜损伤修复过程中,微泡脱落和溶酶体修复满足了不同的细胞需求。公共图书馆ONE 9,e89743 10.1371/journal.pone.0089743-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Babiychuk E.B.和Draeger A.(2015年)。抵抗死亡:细菌毒素损伤质膜后的细胞生存策略。塞明。细胞发育生物学。45, 39-47. 2016年10月10日/j.semcdb2015.10.016-内政部-公共医学
    1. Boye T.L.、Maeda K.、Pezeshkian W.、Sönder S.L.、Haeger S.C.、Gerke V.、Simonsen A.C.和Nylandsted J.(2017年)。膜联蛋白A4和A6在细胞膜修复过程中诱导膜弯曲和收缩。国家通讯社。81623 10.1038/s41467-017-01743-6-内政部-项目管理咨询公司-公共医学