UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy

doi:10.1093/brain/awy237

.2018年10月1日；141(10):2878-2894.

doi:10.1093/brain/awy237。

脊髓性肌萎缩中UBA1/GARS依赖性通路导致感觉运动连接缺陷

附属公司

¹英国爱丁堡大学尤安·麦克唐纳运动神经元疾病研究中心。
²爱丁堡医学院：英国爱丁堡大学生物医学科学。
^三英国爱丁堡大学皇家（迪克）兽医学院罗斯林研究所。
⁴英国邓迪大学指纹蛋白质组学设施。
⁵德国科隆大学人类遗传学研究所、科隆分子医学中心、科隆遗传学研究所和科隆罕见疾病中心。
⁶英国伦敦大学学院神经病学研究所索贝尔运动神经科学和运动障碍系。
⁷英国伦敦大学学院伦敦校区再生和精确医学发现中心。
⁸伦敦大学学院英国痴呆研究所，英国伦敦。

PMID： 30239612
预防性维修识别码： PMC6158753型
内政部： 10.1093/brain/awy237

脊髓性肌萎缩中UBA1/GARS依赖性通路导致感觉运动连接缺陷

汉娜·肖洛克等。大脑. 2018.

.2018年10月1日；141(10):2878-2894.

doi:10.1093/brain/awy237。

附属公司

¹英国爱丁堡大学尤安·麦克唐纳运动神经元疾病研究中心。
²爱丁堡医学院：英国爱丁堡大学生物医学科学。
^三英国爱丁堡大学皇家（迪克）兽医学院罗斯林研究所。
⁴英国邓迪大学指纹蛋白质组学设施。
⁵德国科隆大学人类遗传学研究所、科隆分子医学中心、科隆遗传学研究所和科隆罕见疾病中心。
⁶英国伦敦大学学院神经病学研究所索贝尔运动神经科学和运动障碍系。
⁷英国伦敦大学学院伦敦校区再生和精确医学发现中心。
⁸伦敦大学学院英国痴呆研究所，英国伦敦。

PMID： 30239612
预防性维修识别码： PMC6158753型
内政部： 10.1093/brain/awy237

摘要

由于感觉-运动连接缺陷导致运动神经元失分化是脊髓性肌萎缩发病机制中的一个关键早期事件，但其潜在的分子途径尚不清楚。我们表明，恢复泛素样修饰激活酶1（UBA1）足以纠正脊髓肌萎缩小鼠脊髓中的感觉运动连接。氨酰-tRNA合成酶（包括GARS）被确定为UBA1的下游靶点。UBA1对GARS的调节是通过一种不依赖泛素化的非标准途径实现的。脊髓性肌萎缩症小鼠UBA1/GARS通路的失调扰乱了感觉神经元的命运，与Charcot-Marie-Tooth病相关的GARS依赖性缺陷。在脊髓性肌萎缩症小鼠中，UBA1表达和UBA1/GARS通路恢复后，感觉神经元的命运得到纠正。我们的结论是，脊髓性肌萎缩症中的感觉运动连接缺陷是UBA1/GARS通路中的扰动导致的，UBA1/GAR通路调节感觉神经元的命运，从而突出了脊髓性肌萎缩和夏科特-马里奥病之间的显著分子和表型重叠。

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数字

图1
**UBA1系统性修复后SMA小鼠脊髓感觉运动连接缺陷的修复。**(A类–C类)对照组、SMA和SMA+AAV9-UBA1小鼠的腰椎运动神经元用ChAT（洋红）、VGLUT1（绿色）和DAPI标记。比例尺=10µm。(D类)每个ChAT阳性运动神经元胞体的VGLUT1突触数量的量化。n个=每种情况下3只小鼠，n个>每只小鼠分析20个运动神经元。ns=不显著*对<0.05.

图2
**无标签蛋白质组学分析确定tRNA合成酶为UBA1依赖蛋白。**(A类)用于蛋白质组学筛选的HEK293细胞中UBA1的表达，显示与对照组相比UBA1过度表达（OE）和敲除（KD）。CoxIV和H3=负载控制。(B类和C类)UBA1过度表达的量化(B类)和击倒(C类). Ctrl=控制**对<0.01, ***对<0.001. (D类)BioLayout聚类UBA1过度表达、控制和UBA1敲除的蛋白质组表达的3D表示。节点代表蛋白质，边缘代表蛋白质之间表达的相似性，具有相似表达谱的蛋白质簇用不同颜色表示。显示集群编号。(E类和F类)两个UBA1依赖簇的表达谱在对数尺度上的平均值为±SEM：簇1(E类)和集群4(F类). (**G公司**和**H（H）**)IPA分析显示UBA1过度表达/控制的顶层网络(**G公司**)和UBA1击倒/控制(**H（H）**)，以洋红突出显示的蛋白质上调，以绿色突出显示的蛋白下调。另请参见补充图2-5和补充表1。

图3
**UBA1通过非正则函数影响GARS表达式。**(A类和B类)用泛素-HA（Ub-HA）和UBA1转染HEK293细胞(A类)或UBA1 siRNA(B类); UBA1和泛素的western blot（HA tag免疫印迹），显示多泛素化底物蛋白（Poly-Unb）和游离三泛素（Tri-Ub）、双泛素（Di-Ub）和单泛素（Mono-Unb）。(C类和D类)用GARS-GFP或GFP以及Ub-HA和UBA1转染HEK293细胞(C类)或UBA1 siRNA(D类). 输入对照样品进行UBA1和GARS免疫印迹；GFP免疫沉淀（IP）；对IP样品进行GFP和HA的免疫印迹。显示IgG带和多泛素化（Poly-Unb）涂片。高强度免疫印迹显示多泛素化涂片在增加的激光功率下成像。另请参见补充图6。

图4
**GARS在SMA小鼠的神经组织中失调。**(A类和B类)蛋白质印迹(A类)和量化(B类)来自晚期症状SMA小鼠和对照同窝出生的小鼠的脊髓中的GARS蛋白水平。α-Tubulin（α-Tub）=加载控制。(C类和D类)蛋白质印迹(C类)和量化(D类)晚症状SMA小鼠和对照同窝小鼠DRG中SMN、UBA1和GARS蛋白水平。α-Tubulin（α-Tub），总蛋白（Ponceau）：负荷对照。*n个=*每种情况3只小鼠。另请参见补充图7和8。

图5
**SMA背根神经节的感觉神经元命运被破坏。**(A类)晚症状性SMA小鼠和对照组小鼠腰椎节段1和2的脊柱切片，用NF200（洋红色）和外周蛋白（绿色）标记。DRG概述于顶部面板、方框表示底部面板。细胞的细胞核底部面板标有DAPI。N=NF200阳性神经元；P=外周阳性神经元。比例尺=100µm(顶部)，10微米(底部). (B类和C类)NF200阳性（NF200）百分比的量化⁺) (B类)和外周蛋白阳性（外周蛋白⁺) (C类)感觉神经元。n个=每种情况下3只小鼠，*n个=*每个鼠标4个DRG。(D类和E类)NF200面积的量化⁺(D类)和外周蛋白⁺(E类)感觉神经元。n个=每种情况下3只小鼠，*n个=*每个鼠标2个DRG（7个NF200⁺和七个外周蛋白⁺分析每个DRG的神经元）。(F类)概述了晚期症状性SMA小鼠和对照组小鼠腰椎节段1和2的脊柱切片，这些小鼠的腰段用小白蛋白（白色）、β-III微管蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）、背根神经节（DRG）标记。比例尺=100µm。(**G公司**)小白蛋白阳性感觉神经元的定量，作为β-III小管阳性感觉神经元百分比。n个=每种条件下3只小鼠，*n个=*每个鼠标4个DRG*对<0.05时**对<0.01. 另请参见补充图9。

图6
**SMA小鼠背根神经节感觉神经元UBA1和GARS的失调。**(A类和C类)晚症状SMA小鼠和UBA1a标记的对照小鼠腰椎节段1和2的脊柱切片(A类)或GARS(C类)（绿色）、SMI32（洋红色）和DAPI。DRG概述于概述面板、方框表示降低面板。箭头在底部面板显示UBA1改变的感觉神经元(A类)或GARS(C类)表达式。N=NF200阳性神经元；P=外周阳性神经元。比例尺=100µm(概述)，10微米(降低面板）。(B类和D类)晚症状SMA DRG感觉神经元显示UBA1的核质比降低(B类)GARS的核质比增加(D类)与对照组小鼠相比。n个=每种情况下3只小鼠，*n个=*每只小鼠4个DRG（每个DRG分析14个感觉神经元）*对<0.05, ****P（P）*≤ 0.001.

图7
**在SMA小鼠中恢复UBA1可逆转GARS失调并挽救感觉神经元细胞命运表型。**(A类和B类)代表性荧光蛋白印迹(A类)和量化(B类)来自晚期症状SMA小鼠和注射AAV9-UBA1（SMA+AAV9-UBA1）的SMA小鼠的背根神经节中SMN、UBA1和GARS的表达。α-Tubulin（α-Tub）：负荷控制。*n个=*每种情况3只小鼠。(C类)用UBA1a（绿色）、SMI32（洋红色）和DAPI标记的晚症状SMA和SMA+AAV9-UBA1小鼠腰椎节段1和2的脊柱切片。(D类)用NF200（品红色）和外周蛋白（绿色）标记的晚期症状性SMA和SMA+AAV9-UBA1小鼠的腰椎节段1和2的脊柱切片。(C类和D类)概述了背根神经节（DRG）。(E类和F类)NF200阳性（NF200）百分比的量化⁺) (E类)和外周蛋白阳性（外周蛋白⁺) (F类)感觉神经元。对照小鼠的数据作为参考。n个=每种情况下3只小鼠，*n个=*每个鼠标4个DRG。(**G公司**和**H（H）**)NF200面积的量化⁺(**G公司**)和外周蛋白⁺(**H（H）**)感觉神经元。*n个=*每种情况3只小鼠，*n个=*每只鼠标2个DRG（7个NF200⁺和七个外围蛋白⁺分析每个DRG的神经元）；ns=不显著*对<0.05时**对<0.01. 另请参见补充图10和11。

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[9] Balak CD，Hunter JM，Ahearn ME，Wiley D，D’Urso G，Baumbach-Reardon L.X连锁脊髓性肌萎缩罕见UBA1变异的功能特征。2017年F1000Res；6: 1636.-项目管理委员会-公共医学

[10] Balak CD，Hunter JM，Ahearn ME，Wiley D，D’Urso G，Baumbach-Reardon L.X连锁脊髓性肌萎缩罕见UBA1变异的功能特征。2017年F1000Res；6: 1636.-项目管理委员会-公共医学

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