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.2018年9月17日；6（5）：e00428。
doi:10.1002/p2.428。 电子采集2018年10月。

细胞色素P450s产生的14,15-环氧乙酸促进PC12和大鼠海马神经元细胞突起生长

阿米·奥古罗 1, 井上拓美 2, 苏古鲁·N·库多赫 2, 长冈素素木 1
附属公司

细胞色素P450s产生的14,15-环氧乙酸促进PC12和大鼠海马神经元细胞突起生长

阿米·奥古罗等。 药物研究展望. .

摘要

多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸，在大脑中积累并诱导神经元分化。花生四烯酸通过细胞色素P450s代谢为环氧二十碳三烯酸（EETs）和羟基二十碳四烯酸（HETEs）。在这项研究中，我们发现14，15-EET和20-HETE增强了NGF诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞突起的生长，即使在100nmol L的浓度下也是如此-1LC-MS分析表明，大鼠CYP2C11、2C13和2C23可有效地从花生四烯酸中生成14,15-EET，这些P450在PC12细胞中表达。这些P450的抑制剂酮康唑抑制了神经突起的生长，而抑制可溶性环氧化物水解酶（将EET水解为相应的二醇）可促进神经突起生长。为了确定花生四烯酸代谢物促进轴突形成的机制，我们重点研究了PC12细胞中表达的瞬时受体电位（TRP）通道。TRPV4抑制剂HC067047，而不是TRPV1抑制剂辣椒红素，抑制了14,15-EET对PC12突起生长的影响。此外，14,15-EET增加了细胞内钙离子浓度，HC067047抑制了这种增加。14,15-EET还促进大鼠海马原代培养神经元的突起生长。这项研究表明，P450产生的花生四烯酸代谢物通过钙内流促进神经突起的生长。

关键词：第450页；PC12；环氧乙酸；神经突起生长；大鼠海马神经元细胞。

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数字

图1
图1
增强NGF公司诱导的个人计算机花生四烯酸代谢物导致12细胞突起生长。（A‐D）花生四烯酸(AA公司),EET公司第页，DHET公司s、 或HETE公司s以100的浓度添加到细胞中毫摩尔升−1在50纳克的情况下/毫升NGF48小时。计数具有长度大于细胞体的轴突的分化细胞数量，并从四个不同的培养皿（A和C）中测定分化细胞与细胞总数的比率。控制值设置为1.0。从100（B）或80（D）个细胞中量化细胞的平均轴突长度。（E） 控制值设置为1.0。代表性图片个人计算机用100处理12个细胞毫摩尔升−114,15‐EET公司50 ng时为s/毫升NGF48小时。（F和G）用14,15-EET公司在几种浓度下NGF公司48小时。测定分化细胞与总细胞的比率（F）和100个细胞的平均神经突长（G）。数值为平均值±SE**P（P）< 0.01, *P（P）< 与对照组相比0.05
图2
图2
生产EET公司s和海特大鼠P450s。用细胞色素b纯化大鼠P450的50 pmol5,NADPH公司细胞色素P450还原酶和二脲基磷脂酰胆碱与100μmol L−1花生四烯酸和NADPH公司持续15分钟，用UPLC公司质谱仪。分析物通过串联检测TOF（飞行时间）由总离子监测米/z（z）319.2
图3
图3
抑制个人计算机12细胞突起通过P450抑制剂生长。（A） 14,15‐的蛋白表达EET公司产生P450(CYP公司2C11、2C13、2C23和2E1），20‐HETE公司生产P450(CYP公司4A2），NADPH公司细胞色素P450还原酶（fp2），以及安全环境健康在里面个人计算机12个细胞，含或不含50 ng/毫升NGFwesternblotting检测48小时。星号表示非特定带。用于花生四烯酸代谢分析的纯化大鼠P450用作真实对照。（B和C）酮康唑（0.1‐1μmol L−1)加入50 ng的细胞/毫升NGF48小时。计数具有长度大于细胞体的轴突的分化细胞数量，并从四个不同的培养皿中测定分化细胞与细胞总数的比率（B）。控制值设置为1.0。对80个细胞的平均轴突长度进行量化（C）。控制值设置为1.0。（D和E）抑制剂安全环境健康，N，N′-二环己基脲(数据采集单元)已添加到个人计算机12个电池，50 ng/毫升NGF48小时后测量分化细胞与总细胞的比率（D）和100个细胞的平均轴突长度（E）。数值为平均值±SE**P（P） < 0.01, *P（P） < 0.05. （F‐H）CYP公司2C11、2C13或2C23与花生四烯酸在1μmol L的存在（虚线条）或不存在（阴影条）条件下反应−1酮康唑及其代谢物的LC-MS分析
图4
图4
抑制EET公司神经突起生长增强TRPV公司4抑制剂。（A‐D）非选择性TRP公司抑制剂钌红（1或5μmol L−1),TRPV公司4抑制剂HC公司067047（500毫摩尔升−1)，或TRPV公司1抑制剂辣椒碱（500毫摩尔升−1)已添加到个人计算机12个单元格，其中100个毫摩尔升−114,15‐EET公司和50纳克/毫升NGF48小时。5μmol L−1 注册护士‐1747,TRPV公司4激动剂，添加到含有NGF公司48小时。计数具有长度大于细胞体的轴突的分化细胞数量，并从四个不同的培养皿（A和C）中测定分化细胞与细胞总数的比率。控制值设置为1.0。对80（B）或100（D）个细胞的平均轴突长度进行量化。控制值设置为1.0。数值为平均值±SE**P（P） < 0.01, *P（P）<0.05（E）用50 ng培养细胞/毫升NGF持续48小时，并通过添加乙醇改变细胞钙离子浓度（虚线），170毫摩尔升−114,15‐EET公司（实线），或14,15‐DHET公司Fura‐2检测到（虚线）调幅箭头表示EET公司或DHET公司已添加。（F和G）通过添加乙醇（虚线）或170测量钙离子浓度毫摩尔升−114,15‐EET公司（实线）500nmol升−1钌红（D）或500毫摩尔升−1HC公司067047（东经）。箭头表示EET公司并添加了抑制剂
图5
图5
14,15‐增强大鼠原代培养神经元细胞的生长EET公司（A‐C）在胚胎第18天从Wistar大鼠的海马分离出大鼠神经元细胞，并将其置于聚乙烯亚胺涂层皿上的克隆环内。24小时后，克隆环被移除，14,15‐EET公司(100 毫摩尔升−1)，14，15‐DHET公司(100 毫摩尔升−1)，或TRPV公司4激动剂注册护士‐1747（10μmol L−1)添加到细胞培养基中。24小时后，测量200个细胞（A和B）扩散到自由空间的轴突长度。数值为平均值±SE。暴露于14,15‐EET公司48小时，固定为4%PFA公司用抗神经丝抗体（C）进行免疫荧光分析。（D） 分离的大鼠神经元细胞培养3天，并用Fluo‐4孵育调幅，以及添加乙醇后细胞钙离子浓度的变化（虚线），200毫摩尔升−114,15‐EET公司（实线），或200毫摩尔升−114,15‐EET公司500个毫摩尔升−1HC公司067047（虚线）。箭头指示添加这些试剂的时间**P（P）与对照组相比<0.01
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