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.2018年9月14日;8(1):13793。
doi:10.1038/s41598-018-32227-2。

层粘连蛋白A的骨骼肌营养不良突变改变了免疫球蛋白折叠结构域的结构和动力学

附属公司

层粘连蛋白A的骨骼肌营养不良突变改变了免疫球蛋白折叠结构域的结构和动力学

苏巴娜·杜塔等。 科学代表. .

摘要

A型层粘连蛋白不同结构域的突变导致多种疾病,统称为层粘连病,可影响多个器官。免疫球蛋白折叠是层粘连蛋白A的一个这样的结构域,与许多核相互作用有关,其中突变导致不同的层粘连病。W514R是Ig折叠中的一种突变,导致骨骼肌营养不良(SMD)这一类椎板病的严重表型。在本报告中,我们阐明了在单个氨基酸水平上结构和动力学的总体变化。这些研究表明W514附近残基的构象特征发生了变化。转染突变基因的哺乳动物细胞的成像显示,由于Ig W514R寡聚化增加,核网络受到明显干扰,核相互作用也随之发生改变。因此,这种融合理论和实验程序以预测层粘连病背景下突变体严重程度的新方法可以扩展到许多层粘连a突变体。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
Ig蛋白的过度表达情况:()在顶部面板的4-20%梯度凝胶上分析了纯化到接近同质性的过表达Ig和Ig W514R。底部面板显示了抗-His抗体对蛋白质的表征。如补充图S7所示,凝胶/印迹中所示的条带从原始凝胶/印痕中截取。
图2
图2
Ig W514R改变了二级和三级结构:()25时Ig(黑色)和Ig W514R(红色)的远紫外CD光谱摄氏度。(b条)稳态荧光发射光谱(λex = 295nm)和Ig W514R(红色)。(c(c))将Ig和Ig W514R的荧光各向异性值绘制为包含标准误差的条形图。将Ig和Ig W514R的荧光各向异性值绘制为包含标准误差的条形图。
图3
图3
15N个-114.2获得的Ig折叠域、野生型(黑色)和突变型W514R(红色)的H HSQC光谱具有主干共振分配的T外部磁场。
图4
图4
野生型Ig和突变型Ig W514R的核磁共振化学位移比较:()酰胺化学位移在野生型和突变型Ig W514R之间的残基特异性图(b条)酰胺化学位移变化值映射在核磁共振结构上(PDB:1IVT)。在球体中显示了一些具有相对较高主链酰胺化学位移变化值的代表性残基。(c(c))之间的相关曲线13C类α野生型化学位移突变体Ig W514R(r2 = 0.998). ()特定残留物图13C类α野生型和突变型Ig W514R之间的化学位移差异(e(电子))13C类α核磁共振结构上的化学位移差异。一些在野生型和突变型之间表现出相对显著差异的残基在核磁共振结构中显示为球形。
图5
图5
与野生型相比,Ig W514R表现出不同的动力学:残留物特异性图{1高}-15野生型N-异核NOE()和突变型Ig W514R(c(c))分别,而(b)(野生型)和(d)(突变体)表示核磁共振结构(PDB:1IVT)上映射的相应值。的绘图R(右)2/R(右)1松弛比和来自野生型MD模拟的RMSF(均方根波动)(e(电子))和突变型Ig W514R().R(右)2/R(右)1弛豫比映射在核磁共振结构上,如(f)(野生型)和(h)(突变体)。一些在野生型和突变型中表现出动态行为差异的残基在核磁共振结构中表示为球形。
图6
图6
Ig W514R影响Ig结构域的结合状态:分别对Ig和Ig W5124R进行SEC-MALS分析,显示蛋白质的不同形式。(红线)折射率。(黑线)激光散射。(蓝线)紫外线吸收280纳米。(黑点线)分子量(右轴)。
图7
图7
野生型和突变型Ig的展开方式不同:差示扫描量热法的热像图,用于确定热稳定性和相应的展开行为()免疫球蛋白和(b条)免疫球蛋白W514R。黑色和红色分别表示实验数据和拟合数据。
图8
图8
Ig W514R的平均结构随Ig波动:MD模拟的氨基酸RMSF值(nm)映射到()免疫球蛋白和(b条)免疫球蛋白W514R。色氨酸残基显示为带洋红色的棒状模型。
图9
图9
使用APBS工具获得了Ig和Ig W514R蛋白的静电势图:负静电势以红色突出显示,正静电势以蓝色突出显示。绿色标记用于()免疫球蛋白和(b条)免疫球蛋白W514R。对面的视图为充满空间的模型,Asp和Glu残留物以粉红色突出显示(c(c))免疫球蛋白和()免疫球蛋白W514R。
图10
图10
C2C12中W514R过度表达导致网格尺寸增加:()面板显示EGFP-LA和EGFP-LAW514R的单个平面和3D曲面视图。比例尺 = 5微米。
图11
图11
W514R改变了核膜相关核孔复合体(NPC)的正态分布模式:()LB1在核膜上的分布显示为野生型和突变转染细胞的单一平原。(b条)在野生型和突变转染细胞的两个面板中,已经阐明了核孔复合体在核边缘的定位。用白色方块标记的插图表示由方形方框描述的边缘的缩放(~6倍)部分。比例尺 = 5μm。(c(c))通过NIS Elements版本4.13.00(构建914)计算细胞核外围选定感兴趣区域(ROI)的皮尔逊相关性的示意图。()LA与LB1和核孔复合体共定位的皮尔逊相关性。黑色条代表野生型,红色条代表突变型W514R(错误条代表s.d.,**代表p < 0.001,***代表p < 0.0001).

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