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.2018年11月；23(6):1295-1309.
doi:10.1007/s12192-018-0937-7。 Epub 2018年9月12日。

苦参碱通过抑制有丝分裂和PINK1/Parkin通路促进肝癌细胞凋亡

魏润杰 1, 曹健 2, 姚树坤 三 4
附属公司

苦参碱通过抑制有丝分裂和PINK1/Parkin通路促进肝癌细胞凋亡

魏润杰等。 细胞应激伴侣. 2018年11月.

缩回

摘要

苦参碱是从豆科植物槐的根和茎中分离得到的一种天然生物碱。其对几种癌症的抗增殖和促凋亡作用已被充分证明。然而，苦参碱在调节线粒体稳态，特别是在肝癌细胞凋亡中的有丝分裂中的作用尚不明确。本研究的目的是探讨苦参碱是否通过改变细胞有丝分裂来促进肝癌细胞凋亡。本研究使用HepG2细胞，并用不同剂量的苦参碱处理。通过MTT法、TUNEL染色、western blotting和LDH释放法测定细胞活力和凋亡。用免疫荧光法和western印迹法监测细胞吞噬功能。通过免疫荧光法、ELISA和蛋白质印迹法评估线粒体功能。我们的研究结果表明，苦参碱剂量依赖性地降低HepG2细胞的存活率并增加其凋亡率。功能研究表明，苦参碱治疗通过抑制保护性有丝分裂诱导线粒体功能障碍和激活线粒体凋亡。线粒体自噬的再激活消除了苦参碱对HepG2细胞的促凋亡作用。分子研究进一步证实，苦参碱通过PINK1/Parkin途径调节有丝分裂。苦参碱阻断PINK1/Parkin通路并抑制有丝分裂，而激活PINK1/Parkin途径可增加有丝分裂活性并促进HepG2细胞在苦参碱存在下的存活。总之，我们的数据表明，苦参碱通过抑制有丝分裂和PINK1/Parkin通路的新机制促进HepG2细胞凋亡。这一发现为苦参碱治疗肝癌的分子机制提供了新的见解，并提供了通过调节有丝分裂和PINK1/Parkin通路抑制肝癌进展的潜在靶点。

关键词：HepG2细胞；苦参碱；线粒体功能障碍；线粒体；粉红色/公园小径。

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数字

图1
图1
苦参碱诱导HepG2细胞和Huh7细胞死亡。A类,B通过MTT法评估细胞活性。在HepG2细胞和Huh7细胞培养基中加入不同剂量的苦参碱。C类,D类通过LDH释放测定细胞死亡。用不同浓度的苦参碱处理HepG2细胞和Huh7细胞。E类–G公司观察TUNEL阳性细胞的数量，并用于量化基质介导的HepG2细胞和Huh7细胞凋亡。H（H）–M（M）Western blotting分析蛋白caspase-3和PARP*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图1
图1
苦参碱诱导HepG2细胞和Huh7细胞死亡。A类,B通过MTT法评估细胞活性。在HepG2细胞和Huh7细胞培养基中加入不同剂量的苦参碱。C类,D类通过LDH释放测定细胞死亡。用不同浓度的苦参碱处理HepG2细胞和Huh7细胞。E类–G公司观察TUNEL阳性细胞的数量，并用于量化基质介导的HepG2细胞和Huh7细胞凋亡。H（H）–M（M）Western blotting分析蛋白caspase-3和PARP*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图2
图2
苦参碱调节细胞迁移和增殖。A类,B采用跨孔法观察苦参碱对HepG2细胞的迁移反应。C类,D类包括EGFR和BRAF在内的转移基因的转录在对苦参碱治疗的反应中下调。E类–G公司Western blotting分析钙粘蛋白和波形蛋白的蛋白变化。H（H）,我用EdU染色法对S期增殖细胞进行染色。J型–L（左）通过蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白D1和CDK4的蛋白表达*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图3
图3
苦参碱治疗会导致线粒体功能障碍。A类,BJC-1染色观察线粒体膜电位。JC-1探针的红色荧光表示线粒体健康，JC-1探针绿色荧光表示线粒体电位受损。C类,D类通过流式细胞术测定ROS生成。E类–G公司通过ELISA测定抗氧化剂的浓度。H（H）记录mPTP开放率。苦参碱治疗延长了mPTP的开放时间。我,J型cyt-c的免疫荧光定位。DAPI染色细胞核。苦参碱促进细胞色素c从线粒体泄漏到细胞核。K（K）–问Western blotting分析苦参碱处理细胞中抗凋亡前因子的表达*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图3
图3
苦参碱治疗会导致线粒体功能障碍。A类,BJC-1染色观察线粒体膜电位。JC-1探针的红色荧光表示线粒体健康，JC-1探针绿色荧光表示线粒体电位受损。C类,D类通过流式细胞术测定ROS生成。E类–G公司通过ELISA测定抗氧化剂的浓度。H（H）记录mPTP开放率。苦参碱治疗延长了mPTP的开放时间。我,J型cyt-c的免疫荧光定位。DAPI染色细胞核。苦参碱促进细胞色素c从线粒体泄漏到细胞核。K（K）–问Western blotting分析苦参碱处理细胞中抗凋亡前因子的表达*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图4
图4
苦参碱调节线粒体能量代谢。A类通过ELISA测定细胞ATP生成。B–D类通过ELISA测定线粒体呼吸复合物的活性。E类–H（H）采用Western blotting分析苦参碱处理细胞线粒体呼吸复合体的蛋白表达。我–J型在经苦参碱处理的细胞培养基中测量葡萄糖摄取和乳酸生成*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图5
图5
苦参碱抑制保护性有丝分裂。A类,B通过免疫荧光监测噬菌体活性。线粒体用Tom20染色，溶酶体用Lamp1染色。将有丝分裂活化剂FCCP添加到经苦参碱处理的细胞中，以重新激活有丝分裂。对照组（阴性对照组）使用丝裂原抑制剂3-MA。然后，线粒体和溶酶体的融合表明有丝分裂，这是有记录的。C类–H（H）Western blotting分析与有丝分裂相关的蛋白。将有丝分裂活化剂FCCP添加到经苦参碱处理的细胞中，以重新激活有丝分裂。对照组（阴性对照组）使用丝裂原吞噬抑制剂3-MA。我测定Caspase-9活性以反映有丝分裂在线粒体凋亡中的作用。J型LDH释放试验用于分析有丝分裂对细胞死亡的贡献*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图6
图6
苦参碱通过PINK1/Parkin途径调节有丝分裂。A类–C类使用蛋白质印迹法测量PINK1/Parkin通路的活性。D类–F类PINK1和Parkin的免疫荧光分析。G公司,H（H）将腺病毒过度表达的Parkin（Ad-Parkin）转染到HepG2细胞中，通过western blotting证实其过度表达效率。我,J型用免疫荧光法评估噬菌体。在苦参碱存在下将Ad-Parkin转染到HepG2细胞中*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
图7
图7
PINK1/Parkin通路也参与HepG2细胞的迁移和增殖。A类,B通过跨阱分析评估苦参碱处理或Ad-Parkin转染HepG2细胞的迁移反应。C类,D类转移因子的转录，如钙粘蛋白和波形蛋白。用苦参碱处理HepG2细胞或用Ad-Parkin转染HepG2细胞。E类–G公司Western blotting分析cyclin D1和cyclin E的蛋白表达。H（H）,我细胞增殖的EdU分析。用苦参碱或Ad-Parkin转染HepG2细胞；然后记录EdU阳性细胞的数量*P（P） < 0.05与对照组。对照组、苦参碱组
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