氧化锌 突变导致线粒体脑病和氧化磷酸化缺陷
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氧化锌 突变导致线粒体脑病和氧化磷酸化缺陷
摘要
数字
A类 矢状T1加权FSE显示胼胝体后部变薄，脾发育不全。 也可以看到明显的皮下脂肪沉积。 B类 轴向T1 FSPGR显示由于脾发育不全，第三心室较大，心室心房平行。 C类 患者大脑的MRS显示出正常的光谱模式。
A类 家族谱系详细描述了 氧化锌 变体，索引大小写用红色星号表示。 B类 苏木精和曙红染色（i）和改良Gomori三色染色（ii）显示了肌纤维大小的预期变异性，内部细胞核分离。 没有再生纤维或坏死的证据，也没有典型的“碎裂-红色”变化的肌膜下线粒体聚集体。 在NADH‐四氮唑还原酶（iii）和SDH（iv）反应中都证实了线粒体增殖的缺失。 单个COX反应（v）揭示了整个肌肉冷冻切片中酶活性的均匀损失，在连续COX‐SDH反应（vi）中，COX缺乏的SDH阳性纤维均匀突出。 所示比例尺为50μm。 C类 对照（红色）和患者（蓝色）骨骼肌样品中线粒体呼吸复合物的活性。 对照肌肉的平均酶活性( n个 =25）设置为100%，误差条表示标准偏差。 星号表示超出控制范围的值。 D、 E类 证实性桑格测序显示单亲的每一个亲本都是杂合的 氧化锌 变体。 星号表示标记变体的位置。 F类 通过RT–PCR对患者mRNA的分析表明，c.620G>T变体影响剪接，并可能导致外显子4（p.（Cys207_Glu2545del））或p.Cys207Phe氨基酸取代的跳过。 G公司 OXA1L人Cys207残基的进化保护（蓝盒）。
A类 脑桥表现为双侧空化（i和ii），特别影响桥脚核，伴有微血管增生（iii）、反应性星形胶质细胞增生（iv）和小胶质细胞活化（v）。 神经元和周围神经膜内NDUFS3（vi；箭头）表达下调（对照染色：vii），而SDHA（viii；对照显示在ix）、COXI（x；对照显示于xi）和ATP5B（xii；对照显示位于xiii）表达维持在正常水平。 B类 黑质神经元也显示NDUFS3（i；箭头，右侧显示对照）表达缺失，而SDHA（ii左侧面板；右侧显示对照组）、COXI（iii左侧面板；左侧显示控制组）和ATP5B（iv左侧面板；右图显示控制）表达水平与对照组相当。 C类 纤细束显示脱髓鞘（i和ii），而相邻的楔形束有髓（iii）。 运动神经元的神经元密度保持不变，NDUFB8（iv）和NDUFS3表达（v）减少，SDHA（vi）、COXI（vii）和ATP5B（viii）表达完整。
A类 宏观上，额叶皮质萎缩，胼胝体发育不良。 B类 胶质纤维酸性蛋白（PGFA）免疫组化染色显示丘脑微血管增生，小胶质细胞活化和反应性胶质增生。 比例尺：顶部面板=500μm，左下=200μm，右下=100μm。 C–F 线粒体呼吸链蛋白在额叶（C）、顶叶（D）和枕叶（E）皮质内的患者神经元中的表达与对照神经元（F）的水平相当，并且NDUFS3（i）的表达只有轻微下调，而在患者组织中SDHA（ii）、COXI（iii）和ATP5B（iv）的表达 很高。 比例尺=100μm。
A类 使用VDAC1和β-actin作为负载对照，对患者（P）和对照（C1，C2）成纤维细胞中的OXA1L和OXPHOS复合物亚基进行蛋白质印迹分析。 B类 患者和对照骨骼肌中OXA1L和OXPHOS复合物亚基的Western blot分析。 复合物II亚基SDHA和SDHB用作负荷控制。 C类 利用Blue Native PAGE分析使用DDM作为洗涤剂溶解的患者成纤维细胞中的呼吸复合物组装。 使用NDUFB8（CI）、SDHA（CII）、UQCRC2（CIII）、COXI（CIV）和ATP5A（CV）抗体。* 表示部件复合体。 D类 Blue Native PAGE分析患者膈肌呼吸复合体的组装( P（P） 迪亚 )和股四头肌( P（P） 方庭 ). 使用DDM溶解肌肉线粒体提取物，并使用抗NDUFB8（CI）、SDHA（CII）、UQCRC2（CIII）、COXI（CIV）和ATP5A（CV）的抗体来检测每种复合物。 E类 对照组成纤维细胞（C1、C2）、患者成纤维细胞 氧化锌 （P+OXA1L）。 α-微管蛋白用作负荷对照。 F类 正常化为复合物II（CII）的线粒体呼吸复合物I（CI）、III（CIII）和IV（CIV 氧化锌 （灰色）。 对照成纤维细胞的平均酶活性( n个 =11）设置为100%，误差条表示标准偏差。
A类 CG6404型 对照组（黑色和灰色）和OXA1L siRNA处理苍蝇（红色）的mRNA水平正常化为RpL32 mRNA，对照组1（黑色）设置为1。 每组四个生物重复。 采用Tukey多重比较测试的单向方差分析。 误差条代表平均值的标准误差（SEM）。**** 表示 P（P） < 0.0001. B类 对照组（Ctrl 1，Ctrl 2）和 CG6404型 siRNA缺失（OXA1L-IR）苍蝇。 每组三次生物复制。 Tukey多重比较检验的单向方差分析。 C类 用NT‐siRNA或OXA1L SmartPool siRNA孵育6天后，对细胞裂解液（≈30μg）进行Western blot分析的代表性数字。评估OXA1L和mt‐LSU（MRPL45，MRPL11）和mtSSU（MRPS26，MRPS22）组分的稳态水平， 以及mtDNA编码蛋白COXII的稳态水平。 SDHA和TOM20抗体用作负荷对照。 D类 对细胞裂解物（≈30μg）进行Western blot分析。 用靶向OXA1L的抗体评估消耗效率。 mt编码蛋白COXII以及有丝分裂核糖体蛋白MRPL45和MRPS26的稳态水平也进行了可视化。 使用靶向β-actin的抗体控制负载的均匀性。 这些数字代表了两种生物重复。 虚线表示图中省略了一些车道。 E类 两个独立的细胞系（OXA1L-1和OXA1L-2）在不同浓度的强力霉素（DOX）中生长以调节OXA1L 旗帜 表达式。 通过SDS-PAGE和OXA1L、FLAG表位和TOM20抗体免疫印迹（作为对照）分离线粒体，并与野生型HEK293T细胞（标记为C）的对照线粒体进行比较。 F类 从接受或不接受10 ng/ml DOX处理5天的细胞中分离出线粒体。 在通过免疫印迹法对呼吸复合物I（NDUFA9）、复合物III（UQCRC1）、复合物质IV（COXIV）和复合物V（ATP5A）的超复合物形式进行BN‐PAGE分析之前，将样品溶解在洋地黄素中。 G公司 通过SDS-PAGE和免疫印迹分析核糖体亚基。 印有考马斯亮蓝（CBB）的印迹用于装载控制。
A类 以丙酮酸+脯氨酸为底物的CI+CIII+CIV呼吸。 B类 以sn‐甘油‐3‐磷酸盐为底物的呼吸（在鱼藤酮存在下）。 C类 以TMPD和抗坏血酸为底物的CIV呼吸（在鱼藤酮和抗霉素A存在下）。
A类 与OXA1L‐FLAG相互作用蛋白质的亲和纯化质谱分析。 将表达OXA1L‐FLAG的对照（HEK293T）或OXA1L‐1细胞溶解在1%（w/v）的洋地黄素中，并与抗FLAG亲和凝胶一起孵育( n个 = 3). 通过无标记定量质谱（LFQ）分析洗脱液。 日志 2 将LFQ强度提交给修改后的双面样品 t吨 通过材料和方法中描述的基于排列的错误发现率（FDR）统计确定显著性的测试。 丰富的呼吸复合物亚单位是彩色编码的，mtDNA编码的亚单位是标记的。 数据集EV1中提供了完整数据。 B类 对对照组（C）和OXA1L患者永生化成纤维细胞（P）进行Western blot分析。 OXA1L的稳态水平被评估为OXPHOS系统成分（NDUFB8、COXII和ATP5β）的稳态水平。 在单独的蛋白质印迹上，检测有丝分裂核糖体蛋白MRPL3、MRPL45、MRPL11和MRPS26的水平。 对于这两种膜，β-actin被用作负荷控制。 虚线表示图中省略了一些车道。 C类 对照组（C1）和患者（P）成纤维细胞用盐酸依米汀处理，以抑制细胞溶质翻译和线粒体蛋白合成，通过[ 35 S] Met/Cys合并1小时脉冲和4或8小时追踪。 通过15%聚丙烯酰胺凝胶分离细胞裂解液（50μg）。 凝胶用考马斯蓝（CBB）染色，以确认载荷相等。 固定和干燥后，使用台风FLA9500荧光成像仪对信号进行可视化。 信号是根据既定的迁移模式得出的（Chomyn，1996）。
A类 OXA1L‐213（OXA1L的主要蛋白质编码亚型）在整个可用组织面板中的百万分之转录物（TPM）表达水平箱线图。 方框图显示为中值和25 第个 和75 第个 百分位数； 如果点高于或低于四分位范围的1.5倍，则显示为异常值。 B–K 在减少的组织中，亚型OXA1L‐201至212在TPM中的表达水平。 缩小的组织面板包括动脉主动脉、冠状动脉、大脑杏仁核、大脑皮层、大脑脊髓、细胞转化的成纤维细胞、心耳、心脏左心室和肌肉骨骼。
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引用人
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