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.2018年8月29日；9(1):3502.
doi:10.1038/s41467-018-05660-0。

PP1/PNUTS磷酸酶复合物的MYC去磷酸化调节染色质结合和蛋白质稳定性

Dharmendra Dingar公司 1, 威廉·B·图 1 2, 戴安娜·雷特卡 1 2, 科里·卢伦索 1 2, 阿利亚·塔马奇 1, 杰森·德梅洛 1, 凯瑟琳·胡拉汉 2 三, 曼普雷特·卡尔卡特 1 2, Pak-Kei Chan先生 1, 保罗·布特罗斯 2 三 4, 布莱恩·劳特 1 2, 琳达·Z·潘 5 6
附属公司

PP1/PNUTS磷酸酶复合物的MYC去磷酸化调节染色质结合和蛋白质稳定性

Dharmendra Dingar公司等。 国家公社. .

摘要

c-MYC（MYC）癌蛋白在50%以上的癌症中被解除管制，但控制MYC的调控机制尚不清楚。为此，我们使用BioID质谱（MS）对MYC相互作用组进行了研究，并将PP1（蛋白磷酸酶1）及其调节亚单位PNUTS（蛋白磷酸酶1核靶向亚单位）鉴定为MYC互作用体。我们证明内源性MYC和PNUTS在多种细胞类型之间相互作用，并且它们共同作用于MYC靶基因启动子。通过RNAi或药物抑制抑制PP1导致MYC在多个丝氨酸和苏氨酸残基上的过度磷酸化，通过典型SCF的蛋白酶体降解导致MYC蛋白水平下降FBXW7型途径。MYC过度磷酸化可以通过外源PP1特异性地修复，但不能通过其他磷酸酶修复。高磷酸化的MYC与其转录伙伴MAX保持相互作用，但与染色质的结合明显受损。我们的研究表明，PP1/PNUTS能够稳定增殖细胞中染色质结合的MYC。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
MYC被翻译后修饰并与PP1/PNUTS磷酸酶复合物相互作用。一用MYC单克隆小鼠抗体免疫沉淀生长MCF10A细胞的细胞裂解物，并通过2D凝胶电泳（7 cm，pH为4–7的IPG条带；10%SDS-PAGE），转移到硝酸纤维素膜上，用MYC多克隆兔抗体进行免疫印迹。的代表性图像n个 = 3.显示的是低曝光（顶部面板）和高曝光（底部面板）的x射线胶片图像。箭头显示了许多高分子量MYC斑点。b条所示为通过在HeLa细胞中进行MYC-BioID MS鉴定的选定已知和新的MYC相互作用蛋白的基因名称和光谱计数。A和B是生物复制品，每个都有两个技术复制品。给出了总光谱计数和SAINT分析分数。通过SAINT实现了意义 > 0.8.c（c）蛋白质磷酸酶1（PP1）和蛋白磷酸酶1核靶向亚单位（PNUTS）的示意图。PP1α、β或γ的催化亚单位与调节亚单位（如PNUTS）相互作用，形成与PP1:PNUTS底物相互作用的异二聚体全酶
图2
图2
MYC和PP1/PNUTS在癌症中共同扩增，并与MYC靶基因的启动子共同结合。一 MYC公司和PPP1R10型,PPP1CA公司,PPP1CB基因，或PPP1CC公司基因扩增在乳腺浸润性癌中是明显的，并显示出显著的共发性。b条2009年8月15日MYC公司用PNUTS、MYC和肌动蛋白抗体对敲除细胞（EV）或体外表达MYC的细胞进行裂解和免疫印迹。所示为的代表性图像n个 = 三。c（c）使用MYC或IgG抗体通过染色质免疫沉淀（ChIP）分析MCF10A细胞。通过qPCR定量ChIP’d DNA，以检测MYC或IgG与计算机辅助设计和PPP1R10型启动子或chr6（阴性对照）。d日用MYC兔抗体和/或PNUTS小鼠抗体探测MCF10A细胞。根据制造商的说明，使用双链近接连接分析（PLA）原位红色启动试剂盒（Sigma）分析MYC和PNUTS的接近性。单独使用抗MYC（顶行）、单独使用抗PNUTS（中行）或单独使用抗-MYC和抗PNUTS（底行）探测的细胞显示出典型的PLA信号（红色或白色）和核染色（DAPI；蓝色）。PLA信号被量化，并显示为每个细胞范围内病灶的中位数(n个 = 3). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01，采用Bonferroni检验进行单因素方差分析。比例尺代表20 微米。e（电子）通过ChIP用MYC、PNUTS或IgG抗体分析MCF10A细胞。使用qPCR对与MYC靶基因启动子结合的MYC、PNUTS或IgG的ChIP DNA进行定量，CDK4、NCL、和HES1型或chr6（阴性对照）。（f）对于ChIP-re-ChIP分析，MCF10A细胞裂解物与MYC兔抗体一起孵育，然后是PNUTS（上图）或MAX（下图）抗体以及IgG抗体作为对照。对于ChIP实验，ChIP’d DNA的定量与上述类似。对于c（c）,e（电子）,（f）：所示为输入平均值%(n个 = 3). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001，双向方差分析，采用Bonferroni检验。误差线代表s.d。
图3
图3
抑制PP1导致MYC蛋白水平降低。一Calyculin A处理的MCF10A细胞（50 nM）30 min并裂解以提取蛋白质或RNA。用MYC小鼠、MYC pT58兔或肌动蛋白兔抗体（左面板）对裂解产物的免疫印迹进行检测。#表示非特定带。从提取的RNA中提取cDNA，并使用针对MYC或RPLP0的引物进行qRT-PCR，作为内部对照。数据来自三个生物重复，平均值如图所示***第页 < 0.001; 未成对的t吨-测试，误差条代表标准差。b条MCF10A细胞在1、10、20、30、40、50时用Calyculin A处理 30 nM 最小值（顶板）或2、4、6、8、10 nM用于2 h（底部面板）并溶解。用MYC小鼠或肌动蛋白兔抗体检测免疫印迹。c（c）用MG132（10 µM）用于4 小时 ± Calyculin A（50 nM）30 min并溶解。用MYC小鼠或肌动蛋白兔抗体检测免疫印迹。d日转染10 针对PP1α、β和γ的nM siRNA或通过磷酸钙进行的通用干扰阴性对照。44岁之后 h转染，用10 µM MG132或车辆控制4 h并溶解。用显示的抗体检测免疫印迹。e（电子）生长中的HMEC、MDA-MB-231、BT549、HCC1954、HCC1937或HS578T细胞用Calyculin A（50 nM）30 min并溶解。用显示的抗体对裂解产物的免疫印迹进行了检测。（f）接种表达异位MYC的MCF10A细胞，隔夜培养，血清饥饿24小时 h、 然后用200MOI的空载体腺病毒（AdCMV）或携带小T抗原的腺病毒感染。细胞培养22个 在0.25%血清培养基中培养h，用所示抗体进行裂解和裂解物免疫印迹。所示为的代表性图像n个 = 三
图4
图4
PP1脱磷MYC并将其从SCF中解救出来FBXW7型-依赖性退化。一用Calyculin A（50 nM）或DMSO控制30 min，裂解，用MYC小鼠抗体免疫沉淀。IP用酶对照物小牛肠碱性磷酸酶（CIP）或蛋白磷酸酶1（PP1）治疗2次 30小时 摄氏度。使用底物对硝基苯基磷酸盐（PNP）测量培养2小时后IP反应中的总CIP或PP1酶活性。将IP加载到10%SDS-PAGE上，转移到硝酸纤维素膜上，并用MYC pT58兔或MYC兔抗体进行免疫印迹。图中显示的是n个 = 三。b条在4-羟基三苯氧胺（4-OHT）（48 h） 用溶媒对照（−）或Calyculin A（50 nM）（+）30 最小值或c（c）转染10 针对PP1α、β和γ的nM siRNA或通过磷酸钙进行的普遍干扰阴性对照48 h并溶解。蛋白质裂解物（20 μg）加载到10%SDS-PAGE上，转移到硝化纤维素膜上，并用指示的抗体进行免疫印迹。标准化MYC密度测定值显示在MYC印迹下方。所示为的代表性图像n个 = 三
图5
图5
PP1对MYC上的多个丝氨酸和苏氨酸残基进行去磷酸化。一用MG132（10 µM）用于4 小时 ± Calyculin A（50 nM）30 min、裂解和MYC免疫沉淀，然后进行胰蛋白酶消化、磷酸富集和MS分析。显示了两个技术复制品的肽计数以及具有指定磷酸侧的肽。b条用4-OHT（48）处理MCF10A细胞 h） 以诱导空载体（EV）野生型MYC（MYC-wt）或MYC突变体的表达，其中在一被突变为丙氨酸（MYC12A），用Calyculin A（50 nM）30 min并溶解。蛋白裂解物（20 μg）加载在10%SDS-PAGE上，转移到硝酸纤维素膜上，并用MYC小鼠或肌动蛋白兔抗体进行免疫印迹。所示为的代表性图像n个 = 三。c（c）4-OHT后表达MYC wt或MYC12A的MCF10A细胞（24 h） 用环己酰亚胺（CHX）（10 µg/mL），每隔15分钟采集一次，裂解，通过SDS-PAGE和用MYC或肌动蛋白抗体探测的免疫印迹进行解析（左）。MYC带强度被量化，信号被归一化为肌动蛋白。所示为蛋白质半衰期测定的三个重复的标准化MYC信号（右）
图6
图6
高磷酸化MYC保留与MAX的相互作用，但对染色质结合不利。一用Calyculin A（50 nM）或车辆控制30 min，用MAX兔或IgG兔抗体溶解并免疫沉淀。通过SDS-PAGE解析输入和IP，并用MYC小鼠抗体进行免疫印迹。所示为的代表性图像n个 = 三。b条对于ChIP分析，用MG132（10 µM）用于4 小时 ± Calyculin A（50 nM）30 min，用MYC兔抗体和IgG抗体孵育的裂解物作为对照。通过qPCR对MYC靶基因启动子的ChIP’d DNA进行定量CAD、CDK4、LDHA、和NCL公司和chr6（阴性对照）。c（c）对于细胞核和细胞质分馏，用MG132（10 µM）用于4 小时 ± Calyculin A（50 nM）30 min（左侧面板），或转染10 针对PP1α、β和γ的nM siRNA或通过磷酸钙进行的普遍干扰阴性对照44 h，然后用MG132（10 µM）用于4 h（右侧面板）。使用裂解物进行分级，并用指定的抗体进行免疫印迹。d日携带可诱导FLAG标记EV、MYC wt、MYC12A或MYC12D的MCF10A细胞用4-OHT（24 h） 用MG132（10 µM）用于4 h、 然后裂解用于免疫印迹分析（顶部）或用FLAG或IgG抗体进行ChIP-qPCR（底部），如b条以上。对于b条,d日：所示为%输入平均值（MYC和FLAG ChIP：n个 = 3). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001，双向方差分析，采用Bonferroni检验。无统计学意义 = 纳秒。误差线代表s.d。e（电子）PP1/PNUTS调控MYC过度磷酸化控制染色质结合和降解的模型
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