Mitochondrial Complex I Activity Is Required for Maximal Autophagy

doi:10.1016/j.celrep.2018.07.101

.2018年8月28日；24（9）：2404-2417.e8。

doi:10.1016/j.celrep.2018.07.101。

线粒体复合物I活性是最大自噬所必需的

哈拉·埃尔纳卡特·托马斯¹, 于章¹, 乔纳森·A·斯特菲², Sonia R Veiga公司^三, 乔治·汤姆斯⁴, 萨拉·科兹玛⁵, 卡罗尔·默瑟⁶

附属公司

¹美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液/肿瘤科。
²美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液学/肿瘤学系；美国威斯康星大学麦迪逊分校医学与公共卫生学院医学科学家培训项目。
^三代谢与癌症实验室，加泰罗尼亚肿瘤研究所，ICO，Bellvitge生物医学研究所，IDIBELL，08908巴塞罗那，西班牙。
⁴美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液学/肿瘤学系；新陈代谢与癌症实验室，加泰罗尼亚肿瘤研究所，ICO，Bellvitge生物医学研究所，IDIBELL，08908巴塞罗那，西班牙；巴塞罗那大学贝尔维奇·伊迪贝尔大学医学院生理科学二系生物化学系，08908 L‘Hospitalet de Llobregat，巴塞罗那，加泰罗尼亚，西班牙。
⁵美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液学/肿瘤学系；代谢与癌症实验室，加泰罗尼亚肿瘤研究所，ICO，Bellvitge生物医学研究所，IDIBELL，08908巴塞罗那，西班牙。
⁶美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液/肿瘤科。电子地址：mercerc@ucmail.uc.edu。

PMID： 30157433
预防性维修识别码： PMC6298213型
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2018.07.101

线粒体复合物I活性是最大自噬所必需的

哈拉·埃尔纳卡特·托马斯等。单元格代表. 2018.

.2018年8月28日；24（9）：2404-2417.e8。

doi:10.1016/j.celrep.2018.07.101。

作者

哈拉·埃尔纳卡特·托马斯¹, 于章¹, 乔纳森·A·斯特菲², Sonia R Veiga公司^三, 乔治·汤姆斯⁴, 萨拉·科兹玛⁵, 卡罗尔·默瑟⁶

附属公司

¹美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液/肿瘤科。
²美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液学/肿瘤学系；美国威斯康星大学麦迪逊分校医学与公共卫生学院医学科学家培训项目。
^三代谢与癌症实验室，加泰罗尼亚肿瘤研究所，ICO，Bellvitge生物医学研究所，IDIBELL，08908巴塞罗那，西班牙。
⁴美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液学/肿瘤学系；新陈代谢与癌症实验室，加泰罗尼亚肿瘤研究所，ICO，Bellvitge生物医学研究所，IDIBELL，08908巴塞罗那，西班牙；巴塞罗那大学贝尔维奇·伊迪贝尔大学医学院生理科学二系生物化学系，08908 L‘Hospitalet de Llobregat，巴塞罗那，加泰罗尼亚，西班牙。
⁵美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液学/肿瘤学系；代谢与癌症实验室，加泰罗尼亚肿瘤研究所，ICO，Bellvitge生物医学研究所，IDIBELL，08908巴塞罗那，西班牙。
⁶美国俄亥俄州辛辛那提市辛辛那蒂大学血液/肿瘤科。电子地址：mercerc@ucmail.uc.edu。

PMID： 30157433
预防性维修识别码： PMC6298213型
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2018.07.101

摘要

细胞通过诱导自噬来适应营养和能量剥夺，自噬由哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）和AMP-活化蛋白激酶（AMPKs）调节。我们发现，细胞代谢显著影响诱导自噬的能力，线粒体复合体I功能是反应开始、幅度和持续时间的重要因素。我们发现，复合体I中的苯并咪胍或基因缺陷抑制了mTOR抑制剂诱导的自噬，而增加线粒体代谢的策略增强了自噬。我们报道，mTOR抑制剂以复杂的I依赖性方式显著增加了选择性磷脂和线粒体相关膜（MAM）。我们将复合物I自噬缺陷归因于不能增加MAM、限制磷脂酰丝氨酸脱羧酶（PISD）活性和线粒体磷脂酰乙醇胺（mtPE）活性（支持自噬）。我们的数据揭示了自噬的动态和代谢调节。

关键词：AMPK；自噬；mTOR；代谢；线粒体相关膜；有丝分裂；二甲双胍；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸脱羧酶；磷脂。

爱思唯尔公司出版。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。 — **图1.苯甲醛抑制mTOR抑制剂诱导的自噬**
（A和B）GST-BHMT自噬试验的时间进程（A）和标绘比率用载体（V）处理的HEK293细胞中BHMT片段/GFP-myc（B），5 nMRAD001和20 nM BEZ235（RB）或1 mM二甲双胍（P¹). （C）用0-5 mM处理6小时的HEK293细胞中的GST-BHMT测定二甲双胍单独或与RB联合使用。（D和E）LC3-II通量测定（D）和HEK293中LC3-II/ACTIN（E）的比率按指示处理细胞。（F和G）典型共焦图像（F）和LC3-B定量HEK293T细胞中的puncta/cell（G）。如（D）和（E）所述的处理。比例尺为10微米。数据表示为平均值±1 SD。

图2。 — **图2.Phenformin抑制mTOR抑制剂诱导的线粒体自噬**
（A）商品及服务税_LSCS公司24小时处理细胞的GFP-ActA有丝分裂测定小时，V、RB、P¹或RBP¹（B）线粒体DNA含量，通过RT-qPCR测定。统计依据单向方差分析。（C） Mito-Keima表达细胞的典型共焦图像，处理4小时。（D）从HEK293细胞纯化的线粒体中的复合物I活性。16hr治疗**调整后的p值=0.0074。数据表示为平均值±1标准偏差。

图3。 — **图3线粒体复合体I辅助亚单位严重缺陷抑制自噬**
（A）对照组和*NDUFS6系列*或*NDUFA10型*敲除（KO）细胞。6小时治疗。一个数字显示了归一化为RB的BHMT碎片（碎片）/GFP比值。（B） HEK293细胞经6小时处理后的GST-BHMT测定，含或不含5mM烟酰胺（NM）。（C）政府间贸易_LSCS公司HEK293T对照组和对照组的GFP-ActA有丝分裂测定*NDUFA1型*^击倒对手用V、RB、，P（P）¹，注册银行¹或10μM CCCP（CC）。

图4。 — **图4.苯丙氨酸抑制自噬的起始、振幅和持续时间**
（A）用V、RB、P处理细胞6小时后的GST-BHMT测定¹,RBP公司¹，含或不含1 mM腺苷。（B） V、RB、，P（P）¹，注册银行¹或缺乏葡萄糖。HEK293T细胞中WIPI2的（C和D）免疫荧光hr.典型共焦图像（C）和WIPI2点量化（D）。比例尺为10μm。用V、RB或RBP公司^1.5如western blotting（E）和BHMT图所示片段/GFP比率（F）和LC3-II/ACTIN比率（G）。

图5。 — **图5：葡萄糖饥饿增加自噬和吞噬**
（A和B）经V或RB处理的细胞中GST-BHMT测定时间过程含有25或0 mM葡萄糖的培养基，如western blotting（A）和BHMT-frag/GFP比值（B）。（C）用载体或RB处理24小时的细胞进行GST-BHMT检测含有25或0 mM葡萄糖、25 mM半乳糖（Gal）或100 mM海藻糖的DMEM（Treh）。（D）商品及服务税_LSCS公司24小时处理细胞的GFP-ActA有丝分裂测定小时，25、5或0 mM葡萄糖；25 mM加仑；或P¹、不带或带皇家银行。

图6。 — **图6自噬中磷脂重塑**
（A） HEK293细胞中PE（18:0/18:1）和PS（18:0/10:1）的水平V、RB、P持续24小时¹或RBP¹****p<0.0001，***p=0.0002。ns=不显著。数据表示为平均值±1 SD。（B）非沉默转染细胞的GST-BHMT自噬试验siRNA（siNS）、siPISD-6或siPISD-7。细胞处理6小时。（C）GST-BHMT自噬试验，在用药物处理6小时的细胞中如所述用5mM L-丝氨酸和/或1mM羟胺。（D）如图所示，在处理6小时的细胞中进行GST-BHMT自噬试验，含缓冲液或混合成分脂质体。

图7。 — **图7.复合物I中的缺陷阻止了mTOR抑制剂引起的MAM显著增加**
（A）通过共焦显微镜显示MAM的邻近连接分析。HEK293T细胞处理4小时。比例尺为10μm。（B）显示量化MAM数据的散点图****第页<0.0001. ns=不显著。数据表示为平均值±1 SD。（C）支持或抑制自噬的条件模型。左：mTOR抑制剂（RB）通过以下途径诱导具有健康线粒体的细胞主动自噬增加的MAM、ATG14募集位点和磷脂转运位点，支持mtPE生物合成和持续自噬。RB自噬增强增加TCA中间体、ATP或磷脂的条件。正确的：二甲双胍或复合物I中的缺陷会损害自噬，从而阻止mTOR抑制剂、局部ATP和ATP依赖性诱导的MAM增加转移PS用于mtPE生物合成。

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1. An H和Harper JW（2018年）。人类细胞中核糖吞噬的系统分析揭示了选择性自噬过程中的旁观者流量。《自然细胞生物学》20，135–143。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Auciello FR、Ross FA、Ikematsu N和Hardie DG（2014年）。氧化应激主要通过增加细胞AMP和/或ADP来激活培养细胞中的AMPK。FEBS信函。588, 3361–3366.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Benjamini Y和Hochberg Y（1995年）。控制错误发现率：一种实用且强大的多重测试方法。J.R.Stat.Soc.B 57，289–300。
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[1] Amaravadi RK、Lippincott Schwartz J、Yin XM、Weiss WA、Takebe N、Timmer W、DiPaola RS、Lotze MT和White E（2011）。针对癌症治疗中自噬的原则和当前策略。临床。癌症研究17，654–666。-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Amaravadi RK、Lippincott Schwartz J、Yin XM、Weiss WA、Takebe N、Timmer W、DiPaola RS、Lotze MT和White E（2011）。针对癌症治疗中自噬的原则和当前策略。临床。癌症研究17，654–666。-项目管理咨询公司-公共医学

[3] An H和Harper JW（2018年）。人类细胞中核糖吞噬的系统分析揭示了选择性自噬过程中的旁观者流量。《自然细胞生物学》20，135–143。-项目管理咨询公司-公共医学

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