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.2018年8月28日；9（9）:853。
doi:10.1038/s41419-018-0916-z。

自噬增强导致早产儿脑损伤大鼠模型的兴奋毒性损伤

Céline Descloux公司 1 2, 瓦妮莎·吉奈 1, Coralie Rummel公司 1, 安妮塔·特鲁特曼 三, 朱利安·普亚尔 4
附属公司

自噬增强导致早产儿脑损伤大鼠模型的兴奋毒性损伤

Céline Descloux公司等。 细胞死亡疾病. .

摘要

囊性脑室周围白质软化通常诊断为早产儿，由严重的缺氧缺血性白质损伤引起，也涉及一些灰质损伤。很少有人知道与这些类型的早期脑损伤有关的细胞死亡途径。兴奋性毒性是发育中大脑缺氧缺血性损伤的主要机制。同时，最近有研究表明，在兴奋性毒性条件下，自噬可以增强，将这种生理性细胞内降解系统转换为有害过程。我们在这里研究了自噬在一个经验证的啮齿动物模型中的作用，该模型在某些方面模拟了脑室周围囊性白质软化症的早产兴奋毒性脑损伤。通过在5日龄大鼠幼鼠的皮层下白质（舌下区）注射谷氨酸类似物ibotenate，可诱发影响脑室周围白质和灰质的兴奋性毒性损伤。伊博替酸增强了24小时大鼠脑死亡神经元的自噬，表现为自噬小体的增加（LC3-II和LC3-阳性小点增加）和自噬降解的增强（SQSTM1减少，溶酶体的数量和大小增加（LAMP1-和CATHEPSIN B阳性小泡））。药物性自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤的联合注射不仅阻止了自噬诱导，还阻止了CASPASE-3的激活以及损伤后24小时SPECTRIN的钙蛋白酶依赖性裂解，从而大大减少了长期脑损伤（注射ibotenate后16天），包括侧脑室扩张，脑组织体积和皮质下白质厚度减少。3-甲基腺嘌呤的自噬依赖性神经保护作用在原代皮层神经元培养物中得到了证实，不仅通过药理作用，而且通过基因自噬抑制核糖酸诱导的自吞噬。抑制自噬的策略可以在严重早产脑损伤的情况下代表一种有希望的神经保护方法。

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数字

图1
图1。在幼鼠皮层下白质内注射伊波坦可导致脑损伤。
一典型的甲酚紫染色冠状切片显示脑损伤24 h（出生后6天（第6页））和注射伊波特酸（Ibo）后16天（第21页）。比例尺：1 毫米。b条注射Ibo可激活150–145 kDa血清素/水飞蓟素钙依赖性裂解（SPTAN）（veh:100 ± 6.3%, 6 h伊博：284.4 ± 56.6%, 24 h Ibo:528.1 ± 88.8%）和caspase-3（CASP3）（veh:100） ± 7.13%, 6 h Ibo:702.6 ± 210%, 24 h Ibo:1430.9 ± 271.1%），如代表性免疫印迹和相应的定量所示。平均CASP3值为870.7 ± 男性204.1%，1929 ± 24岁时女性423.5% h.平均SPTAN值为312.1 ± 男性55.9%，720.1 ± 女性24岁时为132.5% h.（车辆：n个 = 11只雌性，10只雄性；6 小时：n个 = 7只雌性，7只雄性；24 小时：n个 = 9只雌性，8只雄性）。男性用黑色三角形表示，女性用白色圆圈表示。c（c）对裂解的CASP3（红色）和神经元标记物RNA结合蛋白Fox-1 Homolog 3（RBFOX3）/NeuN（绿色）进行双重免疫标记显示，CASP3在神经元中激活24 神经元注射Ibo后h。比例尺：20 微米。数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001
图2
图2。在大鼠幼鼠皮层下白质中注射伊波坦可增强神经元的自噬。
一代表性免疫印迹和相应定量显示LC3-II增加（veh:100 ± 3.3%, 6 h Ibo:125.6 ± 8.9%, 24 h伊博：173.2 ± 16.4%），SQSTM1（车辆：100 ± 1.7%, 6 h Ibo:80.5 ± 2.4%, 24 h Ibo:77.3 ± 4%）表达水平6 注射Ibo后h。LC3-II平均值为146.9 ± 男性12%，196.6 ± 24岁时女性为27.5% h.平均SQSTM1值为81 ± 男性为4.4%，74 ± 24岁时女性为6.5% h.（车辆：n个 = 11只雌性，10只雄性；6 小时：n个 = 7只雌性，7只雄性；24 小时：n个 = 9名女性、8名男性）。b条每µm每个神经元（（RNA结合蛋白，Fox-1同源物3）RBFOX3/NeuN（绿色））LC3阳性点（红色）的定量2在共聚焦图像上显示皮层中自噬体的数量增加24 注入Ibo后h（车辆：0.0131 ± 0.001，Ibo:0.1039 ± 0.0083). 每个神经元每µm2的LC3阳性点平均值为0.1366 ± 男性0.0137%，0.0711 ± 接受Ibo治疗的女性为0.0079%。男性用黑色三角形表示，女性用白色圆圈表示。数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001之间。比例尺：20 微米。c（c）受损皮层的超微结构分析显示，6和24岁时胞浆中存在大量自噬体（多膜空泡，箭头）和自溶体（电子致密结构，箭头） h.后期观察到核染色质凝聚和细胞器肿胀（24 h） ●●●●。细胞核（N）。比例尺：1 微米
图3
图3。在大鼠幼鼠皮层下白质中注射伊波坦可增加神经元中自溶体的形成。
一每µm神经元LAMP1阳性点（红色）（MAP2（绿色））的量化2共焦图像显示皮层24中LAMP1阳性溶酶体数量增加 注射Ibo后h（点数：veh:0.018 ± 0.002，Ibo:0.075 ± 0.003/神经元/微米2). 平均值为0.089 ± 男性0.005%，0.057 ± 接受Ibo治疗的女性为0.004%。平均而言，对其大小的测量表明，注射Ibo后存在较大的LAMP1阳性点（平均点面积：veh:0.171 ± 0.002，Ibo:0.685 ± 0.049 微米2)由于大于0.5的点较多 微米2（车辆：7.08 ± 1.90%，Ibo:35.56 ± 2.08%). 平均值为0.571 ± 0.051 微米2/ 38.3 ± 男性3.4%，0.849 ± 0.091 微米2/38.3 ± 接受Ibo治疗的女性为3.4%。b条对每个神经元（（RNA结合蛋白，Fox-1同源基因3）RBFOX3/NeuN（绿色））的CATHEPSIN B（CTSB）阳性点（红色）的量化证实，不仅数量增加（点的数量：M+F公司：0.047 ± 0.003，伊博米+英尺: 0.153 ± 0.004，伊博M（M）: 0.153 ± 0.005，伊博F类: 0.153 ± 0.007/神经元/微米2)而且溶酶体的大小（平均点面积：vehM+F公司: 0.146 ± 0.009，伊博M+F公司: 0.460 ± 0.020 微米2，伊博M（M）: 0.490 ± 0.025 微米2，伊博F类: 0.343 ± 0.021 微米2; 点 > 0.5 微米2：车辆M+F公司: 3.033 ± 0.723%，IboM+F公司: 26.10 ± 1.274%，IboM（M）: 26.8 ± 1.3%，IboF类: 18.6 ± 2.1%). 比例尺：20 微米。数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001之间。（车辆：n个 = 63名女性，30名男性；伊博：n个 = 35名女性，140名男性）。男性用黑色三角形表示，女性用白色圆圈表示
图4
图4。Ibotenate诱导的自噬和细胞死亡通过自噬的药理学抑制而减少。
一在伊波坦（Ibo）治疗前脑室注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）可降低LC3-II + 3-甲基丙烯酸甲酯：64.1 ± 5.3%）并增加SQSTM1（Ibo + 3-甲基丙烯酸甲酯：126.5 ± 4.6%）水平24 注射Ibo后h与用生理盐水（Ibo）处理的大鼠幼崽进行比较 + 生理盐水：LC3，100 ± 3.5%; SQSTM1100型 ± 3.5%），如皮层提取物的代表性免疫印迹和相应定量所示。LC3-II平均值为55.6 ± 男性6.7%，71.5 ± 24岁时女性为7.7% h.平均SQSTM1值为127.4 ± 男性7.2%，127.5 ± 24岁时女性为7.07% 小时。b条3-MA可防止150-145 kDa钙蛋白酶依赖的spectrin/fodrin（SPTAN）裂解（Ibo + 生理盐水：100 ± 8.8%，伊博 + 3-甲基丙烯酸甲酯：51.5 ± 12.9%）和caspase-3（CASP3）（Ibo + 生理盐水：100 ± 9.1%，伊博 + 3-甲基丙烯酸甲酯：55.8 ± 14.4%). 平均SPTAN值为21.7 ± 男性为4.3%，52.7 ± 24岁时女性为12.9% h.CASP3平均值为25.8 ± 男性6.1%，44.8 ± 24岁时女性为13.7% h.数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001之间。（伊博 + 生理盐水：n个 = 15名女性，10名男性；伊博 + 3个月：n个 = 16只雌性，14只雄性）。男性用黑色三角形表示，女性用白色圆圈表示
图5
图5。通过药物抑制自噬，可显著降低长期依波坦诱导的脑损伤。
一损伤后16天（P21）的典型甲酚紫染色脑冠状切片显示了在伊波特酸盐（Ibo）之前注射到同侧脑室的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）的保护作用。比例尺：1 毫米。b条3-MA治疗可减少由Ibo引起的心室扩张（veh + 盐水：0.386 ± 0.086%，伊博 + 生理盐水：7.655 ± 1.233%，Ibo + 3-MA:0.646 ± 0.112%，车辆 + 3毫安：0.366 ± 0.056%). Ibo的平均值 + 盐水处理为6.88 ± 男性1.38%，8.10 ± 女性1.79%，而伊博人1.79% + 3-MA为0.53 ± 男性0.16%，0.78 ± 女性0.21%。c（c）同侧存活组织体积的量化（veh + 生理盐水：49.94 ± 0.167%，Ibo + 生理盐水：41.41 ± 1.486%，伊博 + 3-甲基丙烯酸甲酯：49.22 ± 0.379%，车辆 + 3毫安：49.43 ± 0.428%）相对总脑容量，更具体地说是同侧皮层（veh + 生理盐水：24.09 ± 0.258%，伊博 + 生理盐水：18.76 ± 0.926%，伊博 + 3月3日：23.13 ± 0.329%，车辆 + 3毫安：23.78 ± 0.170%）表明3-MA可以阻止Ibo诱导的脑组织体积减少。Ibo的平均存活组织体积 + 盐水治疗为42.11 ± 男性1.68%，41.02 ± 女性2.16%，而伊博人2.16% + 3-MA为49.92 ± 男性0.34%，48.45 ± 女性为0.59%。d日.3-MA减弱了Ibo诱导的三个不同水平白质厚度的减少：胼胝体（veh） + 生理盐水：452.61 ± 17.16 微米，Ibo + 生理盐水：394.72 ± 28.76 微米，Ibo + 3-甲基丙烯酸甲酯：490.73 ± 11.08 µm，车辆 + 3毫安：433.67 ± 19.19 µm），扣带区（车辆 + 生理盐水：617.54 ± 21.96 微米，Ibo + 生理盐水：369.76 ± 37.63 微米，Ibo + 3-甲基丙烯酸甲酯：560.37 ± 35.46 µm，车辆 + 3毫安：592.40 ± 37.53 µm）和外囊开始处（车辆 + 生理盐水：337.89 ± 18.44 µm，伊博 + 生理盐水：269.80 ± 16.23 微米，Ibo + 3-甲基丙烯酸甲酯：358.28 ± 19.20 µm，车辆 + 3MA公司：338.05 ± 24.81 微米）。3-MA对男性和女性的白质厚度具有类似的保护作用。数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001之间。（车辆 + 生理盐水：n个 = 6只雌性，5只雄性，伊博 + 生理盐水：n个 = 16名女性，9名男性，伊博 + 3-MA：n个 = 8名女性，9名男性，车辆 + 3MA公司：n个 = 3只雌性，3只雄性）。男性用黑色三角形表示，女性用白色圆圈表示
图6
图6。在原代皮层神经元培养中，核糖核酸的兴奋毒性剂量增加了自噬流量。
一Ibotenate（伊博，50 µM）具有神经毒性，如培养神经元培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放所示（veh:7.4 ± 1.1%，1h30:6.4 ± 0.9%, 3 h： 21岁 ± 1.9%, 6 h： 100个 ± 3.2%).b条代表性免疫印迹和相应定量显示LC3-II增加（veh:100 ± 2.7%，1h30:110.4 ± 4.6%, 3 h： 132.3条 ± 8.5%, 6 h： 147.6条 ± 6.6%），SQSTM1（车辆：100 ± 1.5%，1小时30分：89.7 ± 3.3%，3 h： 88.1美元 ± 4.4%, 6 h： 84.2个 ± 4.4%）Ibo治疗后的表达水平。c（c）添加胃蛋白酶抑制素A（PepA）和E64可防止溶酶体降解，如LC3-II水平增加所示（veh Pep/E64:223.2 ± 14.3%）和SQSTM1（车辆Pep/E64:113 ± 2.8%）相对于DMSO处理的神经元（veh DMSO；LC3-II:100 ± 3.3%，SQSTM1:100 ± 2.6%). 添加时4 Ibo前h（3 h） ，PepA/E64治疗导致LC3-II增加更多（Ibo E64/PepA:274.1 ± 19.9%）比E64/PepA或Ibo单独治疗（Ibo-DMSO:148.7 ± 6.7%). E64/PepA预处理抑制Ibo诱导的SQSTM1降解（Ibo-DMSO:84.4 ± 2.2%; 伊博E64/佩帕：120.8 ± 5.5%).d日串联mRFP-GFP-LC3表达质粒6转染培养神经元的典型共焦图像 添加Ibo后h。每µm神经元LC3阳性点数量的量化2显示增强的功能性自噬通量（Total = GFP公司 + RFP+和GFP-RFP+：车辆：0.024 ± 0.003，Ibo:0.174 ± 0.016; GFP公司 + 射频功率 + （早期自噬体）：veh:0.015 ± 0.002，Ibo:0.076 ± 0.007; GFP−招标书 + （自溶体）veh:0.008 ± 0.001，Ibo:0.100 ± 0.011). 比例尺：10 微米。数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001
图7
图7。在原代皮层神经元培养中，自噬的药理学抑制对ibotenate诱导的兴奋毒性具有保护作用。
一3-甲基苯胺（3-MA）预处理1 添加6个i连接（Ibo）之前的h h防止LC3-II增加（车辆：100 ± 5%; 伊博：143.7 ± 7.8%; 车辆 + 3-甲基丙烯酸甲酯：64.6 ± 3.4%; 伊博 + 3-MA:106.1型 ± 6.7%）和SQSTM1减少（车辆：100 ± 1.4%; 伊博：78.4 ± 3.4%; 车辆 + 3-甲基丙烯酸甲酯：131 ± 8.2%; 伊博 + 3-甲基丙烯酸甲酯：104.3 ± 7.1%）由Ibo诱导，如代表性免疫印迹和相应定量所示。b条3-MA可降低培养神经元培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放，从而减少神经元死亡（veh:10） ± 1.7%; 伊博：100 ± 4.3%; 车辆 + 3-MA:8.6 ± 1.4%; 伊博 + 3-甲基丙烯酸甲酯：74.7 ± 7.5%).c（c）E64/PepA预处理减少了神经元死亡，这表明LDH释放减少6 添加Ibo后h（车辆DMSO:16.8 ± 2.9; 伊博DMSO:100 ± 5%; 车辆E64/PepA:21.3 ± 5.8%; 伊博E64/佩帕A:69.6 ± 9.7%). 数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001
图8
图8。在原代皮层神经元培养物中，自噬的遗传抑制对依波连接诱导的兴奋性毒性具有保护作用。
一针对BECLIN1的shRNA的慢病毒转导（BECN1）(供应链shRNA:100个 ± 1.9%;贝肯1shRNA:43 ± 12.3%）和ATG7(供应链shRNA:100个 ± 7.4%;附件7shRNA:63 ± 10.9%）蛋白有效地降低了这两种蛋白的表达。b条,c（c）两者均下调(b条)BECN1和(c（c）)ATG7防止LC3-II增加((b条)车辆供应链shRNA:100个 ± 2.1%; 伊博供应链shRNA:135 ± 9.4%; 车辆附件7小RNA：64.4 ± 9.1%; 伊博附件7小RNA：60.8 ± 6.6%; (c（c）)车辆供应链shRNA:100个 ± 1.8%; 伊博供应链shRNA:125.6 ± 5.5%; 车辆贝肯1shRNA:98.4 ± 4.6%; 伊博贝肯1小RNA：100.6 ± 4.1%），SQSTM1下降((b条)车辆供应链小核糖核酸：100 ± 1.4%；伊博供应链shRNA:93 ± 3.4%; 车辆附件7小RNA：109.5 ± 4%; 伊博附件7小RNA：117.2 ± 3.6%; (c（c）)车辆供应链shRNA:100个 ± 1.4%; 伊博供应链小RNA：91.3 ± 3.2%; 车辆贝肯1小RNA：132.4 ± 19.3%; 伊博贝肯1小RNA：119.4 ± 10.7%）由Ibo诱导（6 h） 如代表性免疫印迹和相应定量所示。d日ATG7和BECN1的下调具有神经保护作用，在培养神经元的培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放减少证明了这一点供应链shRNA:7.2 ± 1.4 %; 车辆附件7shRNA:11.3 ± 1.9%; 车辆贝肯1shRNA:15.9个 ± 3%; 伊博供应链shRNA:100个 ± 7%; 伊博附件7小核糖核酸：71.4 ± 6.3%；伊博贝肯1小RNA：68.8 ± 7%). 数值为平均值 ± 扫描电镜*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001
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