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.2018年9月7:12:829-844。
doi:10.1016/j.omtn.2018.08.001。 Epub 2018年8月8日。

内皮细胞暴露于仿生流波形可鉴定miR-199a-5p作为动脉生成的有效调节因子

约书亚·L·休斯林 1, 凯瑟琳·戈里克 2, 斯蒂芬妮·麦克唐纳 三, 季松 2, Brian H附件 三, 理查德·普莱斯 4
附属公司

内皮细胞暴露于仿生流波形可鉴定miR-199a-5p作为动脉生成的有效调节因子

约书亚·L·休斯林等。 摩尔热核酸. .

摘要

动脉生成，即绕过动脉闭塞的内源性侧支动脉的生长，是一种基本的剪切应力诱导的适应，对治疗外周动脉疾病（PAD）具有重要意义。然而，动脉生成过程中的内皮机制信号尚不完全清楚。在这里，我们测试了一种机械敏感性微RNA miR-199a-5p通过控制单核细胞募集和原动脉生成基因表达来调节股动脉结扎（FAL）后的灌注恢复和侧支动脉生成的假设。我们之前已经证明，如果小鼠FAL后侧支动脉段暴露于逆流，则侧支动脉生成明显增强。我们对暴露于仿生逆流波形的内皮细胞进行了全基因组分析。从这一分析中，我们确定机械敏感性miR-199a-5p是侧支动脉生成的新候选调节因子。在体外，miR-199a-5p抑制原动脉生成基因表达（IKKβ，Cav1）和单核细胞与内皮的粘附。在体内，小鼠FAL后，miR-199a-5p过度表达会损害足部灌注和动脉生成。相比之下，单次肌肉内注射抗miR-199a-5p抗体可引起强劲的治疗反应，包括足部灌注完全恢复，动脉生成显著增强（节段电导增加了3.4倍以上），腓肠肌组织成分得到改善。最后，我们发现间歇性跛行的PAD患者血浆miR-199a-5p水平高于危险因素对照人群。通过我们对响应仿生放大的动脉生成血流波形的内皮机械信号传导的变革性分析，我们已经确定miR-199a-5p既是动脉生成的有效调节因子，也是治疗PAD的假定靶点。

关键词：内皮细胞；股动脉结扎；后肢缺血；miR-199a-5p；微RNA；外周动脉疾病；剪切应力。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
内皮细胞miRNA表达受剪切应力波形的不同调节侧支动脉段的仿生表现出不同的动脉生成反应（A）取自非门控假对照的BALB/c小鼠股薄肌内收侧支的典型血管铸型图像（上图）和股骨动脉结扎（FAL，底部）后第21天组。箭头指示FAL前（黄色）和后（白色）血流的方向和大小。股动脉仅在腹壁动脉的远端结扎，使得一些侧支节段（肌肉）的剪切应力幅度增加2倍（非逆流），而其他节段（隐动脉）的剪切力幅度和逆流方向都增加2倍。侧支动脉的反向流动隐动脉区的动脉生成被放大。（B） 描绘应用于HUVEC以模拟隐静脉（逆流，R）和肌肉（非逆流，N）区域的仿生波形的示意图。（C） Heuslein等人的Affymetrix ST 1.0人类微阵列数据集（n=4）上所有microRNAs（miRNAs）的火山图。HUVEC暴露于（B）中的流波形。在模拟FAL后6小时测定基因表达。FDR，错误发现率。红点表示FDR<0.05的miRNAs。（D–F）（B）（n=3–5）中暴露于仿生剪切应力条件下的HUVEC中成熟miR-199a-5p（D）、miR-146a-5p（E）和miR-29a（F）表达的条形图。学生的t测试。数据为平均值±SEM。
图2
图2
miR-199a（A）对暴露于剪切应力波形下的HUVECs的单核细胞粘附性进行了调节动脉生成性侧支循环的仿生学研究（A）荧光标记的THP-1单核细胞的典型共焦显微镜图像，粘附于转染了miR-199或扰乱模拟物的HUVECs上，然后进行非反转（N）或反转（R）模拟FAL（比例尺，100μm）后6小时，图1B所示的流量波形。插图是放大的300×300μm区域，由白色方框勾勒。（B） 柱状图量化了每种情况下粘附单核细胞的相对数量（n=4）*p<0.05，双向方差分析，随后进行Holm-Sidak多重比较测试。（C） 荧光标记的THP-1单核细胞粘附在转染抗miR-199a或加扰锁定核酸寡核苷酸的流暴露HUVEC上的代表性图像，模拟FAL后6小时（比例尺，100μm）。（D） 柱状图量化了每种情况下粘附单核细胞的相对数量（n=4）*p<0.05，双向方差分析，随后进行Holm-Sidak多重比较测试。数据为平均值±SEM。
图3
图3
miR-199a的过度表达限制了FAL后的足部再灌注，而miR-199a-抑制导致BALB/c小鼠（A和B）的灌注完全恢复。FAL后7天，BALB/c小鼠股薄肌中相对miR-199a-5p的表达。小鼠在FAL后立即肌肉注射7.5 nmol miR-199a模拟物（a）、抗-miR-199a（B）或相应的扰乱寡核苷酸（n=4）。Mann-Whitney U试验。（C和D）通过激光多普勒灌注成像（n=6）评估miR-199a模拟物（C）和抗-miR-199a（D）治疗小鼠的足部灌注恢复。（E和F）miR-199a模拟物（E）和抗-miR-199a（F）治疗小鼠的灌注恢复线图*p<0.05与加扰、重复测量的双向方差分析以及Holm-Sidak检验进行多重比较。数据为平均值±SEM。
图4
图4
miR-199a的过度表达抑制了BALB/c小鼠的动脉生成（A）经scramble-（顶部）或miR-199a-模拟物-（底部）处理的BALB/c小鼠FAL后21天的股薄动脉侧支的典型全血管铸型图像。（B） miR-199a模拟和仓促处理小鼠结扎和未结扎肢体的平均管腔直径沿侧支动脉长度的条形图（模拟组和仓促组分别为5–6）*p<0.001与无门控、双向方差分析，然后进行Holm-Sidak检验进行多重比较。（C） 结扎肢体和非结扎肢体侧支动脉的典型H&E染色横截面。（D–F）H&E染色横截面的管腔直径（D）、壁面积（E）和每壁面积直径（F）条形图（模拟组和混乱组分别为5–6）*p<0.001与无门控、双向方差分析，然后进行Holm-Sidak检验进行多重比较。箭头表示（A）和（C）中的主要侧支动脉。数据为平均值±SEM。
图5
图5
抑制miR-199a可增强FAL（A）治疗后BALB/c小鼠的动脉生成。FAL（上）或抗miR-199a-（下）治疗后21天，非靶向小鼠股薄肌侧支动脉的典型全身血管铸型图像。（B） 抗miR-199a和仓促处理小鼠（n=6）结扎和未结扎肢体的平均管腔直径沿侧支动脉长度的条形图*p<0.001与无门控、双向方差分析，然后进行Holm-Sidak检验进行多重比较。（C） 结扎肢体和非结扎肢体侧支动脉的典型H&E染色横截面。（D–F）H&E染色横截面的管腔直径（D）、壁面积（E）和每壁面积直径（F）条形图（n=6）*p<0.001与无门控、双向方差分析，然后进行Holm-Sidak检验进行多重比较。箭头表示（A）和（C）中的主要副动脉。数据为平均值±SEM。
图6
图6
用miR-199a模拟物或干扰模拟物治疗BALB/c小鼠7天后，用免疫标记巨噬细胞标记物Mac3（绿色）、平滑肌α-肌动蛋白（SMαA，红色）和细胞核（DRAQ5，蓝色）的纤细侧支动脉区域的代表性横截面miR-199（A）调节侧支巨噬细胞的募集。虚线表示用于量化的侧支循环周围区域（距离血管壁25μm）。箭头表示Mac3+电池（标尺，25μm）。（B） 侧支膜Mac3条形图+细胞（miR-199a模拟和置乱分别为4–5个）*p<0.05，学生t检验。（C） FAL后7天，BALB/C小鼠经抗miR-199a或干扰寡核苷酸治疗后，出现免疫标记的股薄肌侧支动脉区域，如（A）所示。（D） 侧支膜Mac3条形图+细胞（n=3）*p<0.05，学生t检验。数据为平均值±SEM。
图7
图7
miRNA-199a抑制改善FAL手术BALB/c小鼠的腓肠肌组成（A和B）FAL后立即用打乱（A）或抗miR-199a（B）锁定核酸寡核苷酸处理的BALB/c小鼠结扎肢体腓肠肌H&E染色的代表性图像（标尺，500μm；插入标尺，50μm）V，活肌肉；N、 坏死组织；F、 纤维脂肪组织。（C和D）用Scramb（C）或抗miR-199a（D）（标尺，500μm）处理的BALB/C小鼠结扎肢体的Masson染色腓肠肌的代表性图像。蓝色染色表示胶原和/或纤维含量，而红色染色表示健康组织。（E） 各组（n=5）在FAL后第21天存活（白色）或不存活（黑色）腓肠肌百分比条形图。（F） 各组（n=5）在FAL后第21天腓肠肌相对纤维化区域的条形图*p<0.05 vs scramble，Student t检验。数据为平均值±SEM。
图8
图8
间歇性跛行日志患者血浆中miR-199a-5p表达升高2间歇性跛行（PAD）患者血浆中miR-199a-5p表达与危险因素对照人群（C）的倍数变化。血浆miR-199a-5p表达归一化为RNU6（n=25）*p<0.05，学生t检验。数据为平均值±SEM。
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