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.2018年8月27日;8(1):12856.
doi:10.1038/s41598-018-31318-4。

与多发性硬化相关的GluA2-GAPDH复合物对星形胶质细胞特性的特异性改变

附属公司

与多发性硬化相关的GluA2-GAPDH复合物对星形胶质细胞特性的特异性改变

弗兰基·H·F·李等。 科学代表. .

摘要

有强有力的证据表明,神经炎症是多发性硬化(MS)的重要介质,星形胶质细胞增生在这一过程中起着重要作用。令人惊讶的是,星形胶质细胞在疾病发展过程中发挥着矛盾的作用,但其机制尚不清楚。此前,我们曾报道,在EAE小鼠MS模型中,给药一种特异性干扰GluA2-GAPDH相互作用的干扰肽(GluA2-G-Pep)可以缓解神经症状。在本研究中,我们验证了在LPS诱导的初级反应性星形胶质细胞中GluA2/GAPDH复合物升高,GluA2-G-Gpep治疗显著降低EAE小鼠和反应性星形胶质细胞中GFAP的表达水平。进一步的体内和体外分析表明,GluA2-G-Gpep给药使EAAT1和EAAT2表达正常化,通过AQP4挽救受损的血脑屏障完整性,促进肌动蛋白重组并改变线粒体动力学。这些改变可能部分由核GAPDH和p53转录途径的改变解释。我们的发现为理解与MS相关的GluA2-GAPDH调节的星形胶质细胞特性提供了关键意义,并为针对星形胶质细胞的新治疗方案提供了见解。

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数字

图1
图1
破坏GluA2-GAPDH与GluA2-G-Gpep的相互作用可降低EAE小鼠的星形胶质细胞反应性。()代表性荧光图像显示假手术、EAE、EAE脊髓切片中GFAP标记的星形胶质细胞和TAT控制肽(10μM)和EAE与GluA2-G-Gpep(10μM)小鼠。比例尺:100μm。高倍图像如下所示。比例尺:20μm。分析区域包括背部、中间和腹部灰质。(b))GFAP数量显著增加+比较所有脊髓区域假对照组的EAE和EAE细胞与TAT对照肽组。与对照组相比,GluA2-G-Gpep处理产生了GFAP标记的细胞数量的显著减少。(c(c))使用荧光强度的平均灰度值量化星形胶质细胞反应性,并使用ImageJ从标准化阈值尺度测量面积占用百分比。EAE和EAE + 与假动物相比,TAT对照组pep小鼠的荧光强度值和荧光占有率显著升高,而服用GluA2-G-Gpep降低了这两个参数(sham:n = 12; EAE:n个 = 10; TAT-对照肽:n = 16; GluA2-G-糖蛋白:n = 来自3条不同脊髓的13个切片,双向ANOVA,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。(d)Western blot实验证实了不同组间GFAP表达的变化(n = 每组4条脊髓,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。显示全长印迹,用肌动蛋白负荷对照标准化蛋白质表达的量化,并表示为假手术组的百分比。数据以平均值表示±扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.假手术,+第页 < 0.05,++第页 < 0.01 vs.使用GluA2-G-Gpep的EAE。
图2
图2
GluA2-G-Gpep治疗改变星形胶质细胞特异性AQP4的表达模式,并挽救EAE小鼠血脑屏障通透性受损。()GluA2-G-Gpep小鼠标记假手术组、EAE组和EAE组AQP4/GFAP、IgG和闭塞素的脊髓切片免疫组织化学。右侧显示了放大倍数较高的图像。比例尺:100μm(左),20μm(右)。AQP4在假小鼠中主要以GFAP-星形胶质细胞的圆形模式表达,但EAE组的分布更广泛,不局限于星形胶质细胞。通过小鼠脊髓内IgG渗出和闭塞素表达模式分析血脑屏障完整性。与假对照组相比,EAE小鼠表现出显著的IgG表达和阻断紧密连接结构。令人惊讶的是,GluA2-G-Gpep处理逆转了这些变化。(b条)对EAE小鼠荧光信号强度的量化显示,AQP4和IgG显著增加,但GluA2-G-Gpep仅产生轻微降低。各组间闭锁素表达水平无差异。(假名:n = 8; EAE:n个 = 6-8个;GluA2-G-糖蛋白:n = 3条不同脊髓的7–8个切片,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。数据以平均值表示±扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.假手术。
图3
图3
GluA2-G-Gpep治疗可有效降低EAE小鼠体内EAAT1和EAAT2表达水平的增加。(a、b))假手术、EAE和EAE与GluA2-Gpep小鼠脊髓的EAAT1和EAAT2免疫荧光图像。荧光强度的热图如下所示。比例尺:100μm。与假手术组相比,EAE组EAAT1和EAAT2荧光信号均显著增加,但服用GluA2-G-Gpep显著降低了与对照组相当的转运体水平。对EAAT1和EAAT2荧光强度的量化结果表明,所有组的趋势相似。(假名:n = 10–12; EAE:n个 = 10; GluA2-G-糖蛋白:n = 来自3条不同脊髓的12个截面,单向方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。数据以平均值表示±扫描电镜**第页 < 0.01 vs.假手术,++第页 < 0.01 vs.使用GluA2-G-Gpep的EAE。
图4
图4
在原代星形胶质细胞培养中,GluA2-GAPDH相互作用的中断直接影响星形胶质细胞的形态和反应性。(a))对原代星形胶质细胞培养物进行GFAP免疫染色,并在低倍放大10倍的条件下拍摄荧光图像,以提供星形胶质细胞培育物的整体视图。比例尺:100μm。(b)GFAP的百分比+细胞以每总数中GFAP标记的细胞数进行测量。与未经治疗的对照组相比,带有LPS的反应性星形胶质细胞和带有TAT控制肽的LPS的比例明显较高,但GluA2-G-Gpep治疗有效地减少了这种增加(未经治疗:n = 15; LPS:n个 = 13; TAT-对照肽:n = 13; GluA2-G-糖蛋白:n = 来自3种不同文化的12个ROI,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。(c)60倍放大率更高的图像×捕获用GFAP免疫染色的单个星形胶质细胞进行形态学分析。比例尺:20μm。(d))与对照组相比,LPS刺激的星形胶质细胞的GFAP荧光强度、星形胶质细胞表面积和一级分支数量显著增加。GluA2-G-Gpep给药降低了GFAP强度和初级突起数量,但不降低星形胶质细胞表面积(不治疗:n = 22; LPS:n个 = 23; GluA2-G-糖蛋白:n = 来自3种不同培养物的25个星形胶质细胞,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。(e))Western blot分析证实,LPS诱导的星形胶质细胞中GFAP蛋白的表达高于未处理的细胞,GluA2-G-Pep处理能够将其表达恢复到对照水平(n = 每组4种不同的培养物,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。完整的Western印迹如补充图4a所示。(f)原代星形胶质细胞的时间推移成像进一步揭示了LPS诱导的星形胶质细胞中中间丝强烈发育的更多过程。一直以来,GluA2-G-Gpep治疗使该表型正常化,形成的纤维较少。白色箭头表示星形胶质细胞过程的变化。比例尺:20μm。(g)时间0到60之间星形胶质细胞表面积百分比变化的量化LPS处理后的小时数显著增加,但添加GluA2-G-Ppep后小时数减少(不处理:n = 7; LPS:n个 = 7; GluA2-G-糖蛋白:n = 来自3种不同培养物的6个细胞,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。数据以平均值表示±扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.不治疗,+第页 < 0.05,++第页 < 0.01 vs.使用GluA2-G-Gpep的LPS。
图5
图5
GluA2-G-Gpep治疗可部分改变原代星形胶质细胞中AQP4的表达模式,但不影响AQP4。(a)利用带有LPS和LPS的星形胶质细胞上的AQP4抗体进行免疫细胞化学的代表性荧光图像 + GluA2-G-Gpep处理。AQP4荧光的热强度图显示,在未处理的细胞中,AQD4定位于细胞边缘附近和细胞质内。LPS刺激后,更多的AQP4向细胞质和细胞核区域转移。GluA2-G-Gpep处理导致AQP4在细胞核附近和细胞质内的分布相似,但在周边区域较少。比例尺:20μm。(b)Western blot结果表明,与非治疗对照组相比,LPS刺激的星形胶质细胞中AQP4蛋白水平显著升高。GluA2-G-Gpep的添加并没有将这种增强逆转回控制水平,尽管表现出下降趋势(n = 每组4种不同的培养物,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。完整的Western印迹如补充图4a所示。数据以平均值表示±扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.不治疗。
图6
图6
GluA2-G-Gpep降低LPS诱导的反应性星形胶质细胞中增强的EAAT1和EAAT2表达,但不影响谷氨酸摄取活性。(,c(c))原代星形胶质细胞中EAAT1和EAAT2的免疫荧光图像显示,细胞内两种转运蛋白的表达均显著增加,但在给予GluA2-G-G-Gpep后显著降低。比例尺:20μm。(b条,d日)通过Western blot定量EAAT1和EAAT2蛋白水平产生了一致的结果,LPS反应性星形胶质细胞表现出较高的表达,肽处理组恢复到正常水平(n = 每组4种不同的培养物,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。(e(电子))通过测量0、5、10和15时的谷氨酸浓度来评估初级星形胶质细胞的谷氨酸摄取功能添加50分钟后μM胞外谷氨酸。LPS和LPS的谷氨酸浓度略有下降 + GluA2-G-Gpep组10和15天后min.当计算15时谷氨酸的还原百分比时min,我们观察到LPS-星形胶质细胞的百分比较高,但肽治疗并没有改变摄取活性(n = 每组3种不同的培养物,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。对每个样品进行两次谷氨酸浓度试验。不同组间的所有数据均未达到统计学意义。全长的西方斑点(b条,d日)如补充图4a所示。数据以平均值表示±扫描电镜*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.不治疗,++第页 < 0.01 vs.使用GluA2-G-Gpep的LPS。
图7
图7
GluA2-GAPDH破坏可恢复反应性星形胶质细胞中的线粒体形态,但对细胞因子释放无影响。(a)用有丝分裂跟踪器红显示原代星形胶质细胞线粒体形态的典型荧光图像。右侧显示线粒体的高倍放大图。与对照组相比,LPS处理的星形胶质细胞显示出明显较小的线粒体,这是线粒体分裂的特征。添加GluA2-G-Gpep后,线粒体形态变长,异常表型得以恢复。比例尺:20μm(左),5μm(右)。(b))测量各组的平均线粒体长度。LPS处理的星形胶质细胞的线粒体长度比未处理的星形细胞短,而GluA2-G-Ppep处理的线粒体长度与对照组相似(n = 每组来自3种不同培养物的100个线粒体,单因素方差分析后接Bonferroni事后(post-hoc)测试)。(c))对不同处理的原代星形胶质细胞培养物进行细胞因子评估,结果显示,在LPS刺激下,IL-1β、IL-6和TNFα显著增加。IL-10、IL-17和IFNγ水平没有变化。此外,GluA2-G-Gpep对这些特定细胞因子的释放没有调节作用(n = 每组3种不同的培养物,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。对每个样本进行两次细胞因子实验。数据以平均值表示±扫描电镜**第页 < 0.01 vs.不治疗,++第页 < 0.01 vs.使用GluA2-G-Gpep的LPS。
图8
图8
GluA2-G-Gpep治疗可减少LPS刺激的星形胶质细胞中升高的核GAPDH、p53和p53(S15)。(a)免疫荧光图像标记不同处理的原代星形胶质细胞中的GAPDH。高倍图像显示在右侧。LPS刺激的星形胶质细胞在核膜附近和细胞核内的GAPDH显著增加,但GluA2-GAPDH与GluA2-G-Pep相互作用的中断阻止了这种作用。比例尺:20μm(左),5μm(右)。(b)量化细胞核周围的GAPDH荧光强度,可以在LPS处理的细胞中产生类似的高表达结果,而GluA2-G-Pep(n = 来自3种不同培养物的8个细胞,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。(c,d))用核分数星形胶质细胞蛋白进行的Western blot分析导致GAPDH蛋白水平增加,以及p53和p53用LPS磷酸化S15。GluA2-G-Pep处理显著地将表达逆转至对照水平(n = 每组3种不同的培养物,单因素方差分析,然后是Bonferroni事后(post-hoc)测试)。完整的Western印迹如补充图5b所示。数据以平均值表示±扫描电镜*第页 < 0.05与不治疗,+第页 < 0.05,++第页 < 0.01 vs.使用GluA2-G-Gpep的LPS。

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