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.2018年8月23日；13（8）：e0200674。
doi:10.1371/journal.pone.0200674。 2018年eCollection。

幼年粘膜匀浆在猪肠缺血损伤和修复模型中修复新生空肠上皮修复缺损

阿曼达·L·齐格勒 1, 蒂凡尼A Pridgen 1, 朱莉安娜·K·米尔斯 1, 利亚拉·冈萨雷斯 1, 劳里安娜·范·兰德亨（Laurianne Van Landeghem） 2, 杰克·奥德 三, 安东尼·布利克斯拉格 1
附属公司

幼年粘膜匀浆在猪肠缺血损伤和修复模型中修复新生空肠上皮修复缺损

阿曼达·L·齐格勒等。 公共科学图书馆一号. .

勘误表in

摘要

肠缺血损伤导致粘膜上皮脱落，导致宿主败血症和死亡，除非粘膜屏障迅速恢复。婴儿的惊厥和新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）与肠缺血、败血症和高死亡率有关。我们使用一种高度可翻译的猪模型描述了肠缺血/修复的特征，在该模型中，幼年猪（6-8周龄）通过快速上皮修复和紧密连接重新组装，完全有效地恢复屏障功能。相反，单独的研究表明，较年轻的新生猪（2周龄）屏障功能恢复较差，这可能是缺血性肠病婴儿高死亡率的重要原因。因此，我们旨在进一步完善我们的修复模型并描述新生儿屏障修复中的缺陷。在这里，我们检查了新生儿粘膜修复缺陷，我们假设该缺陷与上皮细胞和上皮下细胞的发育不足有关。新生猪和幼猪的空肠缺血后，将受损粘膜从浆膜肌层剥离并在体外恢复，同时监测经上皮电阻（TEER）和3H-甘露醇流量，作为屏障功能的测量。虽然缺血损伤的幼年粘膜使TEER恢复到对照水平以上，恢复期内流量减少，伤口闭合率为93±4.7%，但新生儿的TEER没有变化，流量增加，上皮伤口大小增加11±23.3%。扫描电子显微镜显示，新生儿伤口边缘的肠细胞未能呈现出幼年肠细胞的恢复表型。为了尝试抢救受伤的新生儿粘膜，在体外恢复、全厚肠体外恢复、体内恢复和直接应用新生儿或青少年受伤粘膜匀浆期间，重复新生儿实验，添加外源性前列腺素。外源性前列腺素、完整的浆膜肌层肠和体内恢复均未增强缺血损伤新生儿粘膜的TEER或恢复。然而，体外外源性应用损伤的幼年粘膜匀浆可显著增加TEER，并使损伤的新生儿粘膜组织恢复到80±4.4%的上皮覆盖率。因此，新生儿粘膜修复可以通过直接接触幼猪缺血损伤粘膜的细胞和非细胞环境来挽救。这些发现支持了这样一种假设，即新生儿粘膜修复缺陷是由于粘膜室中不成熟的修复机制造成的。未来的研究将确定和挽救新生儿肠道修复机制中的特定缺陷，这将推动开发新的临床干预措施，以降低受肠缺血损伤影响的婴儿的死亡率。

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图1
图1。新生儿和青少年缺血性损伤后，绒毛表现出类似的形态变化。
（A） 受伤后绒毛高度降低，120分钟后绒毛进一步缩短体外新生儿和青少年的恢复（新生儿双向方差分析显示恢复和损伤时间对绒毛高度有显著影响，P<0.05；青少年双向方差分析表明恢复对绒毛高度影响显著，P<0.05）。（B） 组织形态计量学量化了两个年龄组随着缺血持续时间的增加上皮化的类似减少（损伤增加）（通过双向方差分析，缺血对上皮化的显著影响，P<0.0001，根据Sidak的多重比较测试，在每个损伤持续时间，年龄组之间没有显著差异）.
图2
图2。缺血导致两个年龄组的上皮损伤相似。
（A） 在新生儿（顶行）和幼年（底行）空肠粘膜的固定冰冻切片上探测基底膜成分胶原蛋白IV（红色）和绒毛（绿色），作为成熟绒毛肠细胞刷状缘的标记。注意，缺血诱导的肠细胞丢失主要局限于绒毛尖端（白色箭头），两个年龄组受损粘膜的基底膜完整（代表性区域n=3/组，标尺100μm）。（B） iFABP（绿色）局限于肠细胞的细胞质，在两个年龄组的绒毛尖端表达增加。请注意，伤口相邻的肠细胞（白色箭头）在新生儿和青少年受伤的绒毛中表达iFABP（代表性区域n=3/组，比例尺100μm）。
图3
图3。新生儿缺血后，由于恢复失败，体外屏障功能无法恢复。
（A） 在Ussing腔室中进行120分钟以上的体外恢复。注意，在缺血损伤的30分钟、45分钟和60分钟的幼年粘膜中，TEER在体外恢复，而所有缺血损伤的新生儿组织未能在120分钟内恢复TEER（n=5-17，在三次重复测量ANOVA中，恢复与年龄之间存在显著交互作用，P≤0.001）。（B） 30分钟缺血损伤组织与120分钟以上对照组的TEER体外恢复（Sidak多重比较试验的双向方差分析，*P≤0.05，**P≤0.01）。（C） 中的更改三30分钟缺血损伤组织中相对于对照组的H-甘露醇流量体外恢复期。注意，新生儿的小分子通量没有变化，而幼年组织通量从恢复期开始到结束都有所下降（n=6，Student t检验，*P≤0.01）。（D） 典型的组织学检查显示，与幼年绒毛的恢复上皮（箭头）（标尺100μm）相比，恢复后新生儿绒毛尖端30分钟缺血损伤的粘膜上皮仍然存在缺陷。（E） 组织形态计量学量化了青少年伤口闭合率为93±4.7%，而新生儿伤口大小增加了11±23.3%（n=6-18，*P≤0.05，学生t检验）。
图4
图4。扫描电子显微镜显示，新生儿创伤相关肠细胞未能呈现出幼年人的迁移表型。
（A） 新生儿和幼年绒毛缺血30分钟。注意两个绒毛尖端的肠细胞脱落（星号）和同心褶皱，表明新生儿绒毛核心收缩和表面上皮聚束（代表n=31000x，标尺30μm）（B）新生儿和幼年绒毛缺血30分钟和30分钟后体外恢复。注意新生儿伤口邻近细胞（左）中的微绒毛（白色箭头）呈球形且持续存在，而幼年期（右）的跛足前缘（白色箭头，由白色虚线勾勒出的伤口边缘）光滑，延伸至剩余的缺损（星号）。（代表n=3、5000x和10000x，比例尺为10μm和3μm）。
图5
图5。全厚度外源性前列腺素的作用体外和体内缺血30分钟后新生儿恢复。
（A） 对照组的典型组织学检查，缺血30分钟和120分钟体外添加1uM 16,16-二甲基前列腺素E恢复新生儿空肠2到基底外侧室。注意恢复组织中的持续上皮缺损（标尺100μm）。（B） 与对照组98±2.0%的上皮化相比，组织形态计量学分别量化了损伤组织和前列腺素恢复组织中74±2.5%和68±13.3%的上皮化（n=3，n.s.=不显著，**P<0.01，未配对t检验）。（C） 对照组代表性组织学检查，30分钟缺血，30分钟缺血性，120分钟全厚体外新生儿空肠恢复（比例尺100μm）。（D） 组织形态计量学定量了损伤和全层30±6.3%和27±12.6%的上皮化体外与对照组的100±0.0%上皮化相比，恢复的组织分别为（n=4，n.s.=不显著，***P<0.0001，未配对t检验）。（E） 对照组、30分钟缺血、30分钟和120分钟缺血的典型组织学体内新生儿空肠恢复（比例尺100μm）。（F） 组织形态计量学定量了受伤和体内恢复组织分别与对照组100%上皮化（n=5-7，n.s.=不显著，**P<0.01，未配对t检验）。
图6
图6。外源性应用受伤的幼年粘膜匀浆可部分挽救受伤新生儿空肠的屏障修复。
（A） 使用幼年（juv）而非新生儿（neo）损伤的粘膜匀浆在体外复苏挽救了缺血损伤的新生儿空肠TEER。仅应用于顶端或基底外侧不能挽救TEER。所提供的数据相对于每个组织自身的初始TEER进行了标准化处理（n=5-6，通过双向方差分析，治疗和恢复对TEER的显著影响，P≤0.001；**P<0.01，***P<0.001，通过Dunnett的多重比较测试）。（B） 代表性组织学检查显示，与幼年匀浆处理组织中部分恢复上皮（箭头）的证据相比，新生儿匀浆处理的组织中仍存在缺陷（n=6-12，比例尺100μm）。（C） 组织形态计量学量化了组织两侧损伤的幼年粘膜匀浆的上皮覆盖率为80±4.4%，而所有其他治疗组的上皮覆盖率为40-60%（n=6-12，通过单因素方差分析，治疗对上皮覆盖率的显著影响，通过Dunnett多重比较检验，P<0.01，*P<0.05）。
图7
图7。外源性应用新生儿或青少年粘膜匀浆上清液并不能挽救受伤新生儿空肠的屏障修复。
（A） 幼年（juv）和新生儿（neo）损伤的粘膜匀浆上清液在体外复苏可以挽救缺血损伤的新生儿空肠TEER。所提供的数据相对于每个组织自身的初始TEER进行了标准化（n=5；双向方差分析显示治疗对TEER有显著影响，但没有恢复，P<0.001；通过Dunnett的多重比较测试，与Ringer的对照组相比，没有显著差异）。（B） 代表性组织学检查显示，与幼年匀浆处理组织中部分恢复上皮（箭头）的证据相比，新生儿匀浆处理的组织中仍存在缺陷（n=6-12；比例尺100μm）。（C） 组织形态计量学量化了林格恢复组织中70±8.4%的上皮覆盖率，与上清液处理组的上皮覆盖度无差异（新生儿和青少年分别为61±11.0%和71±11.3%）（n=5-6；单向方差分析无差异）。
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