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.2018年11月；42(5):2569-2583.
doi:10.3892/ijmm.2018.3830。 Epub 2018年8月17日。

人胎盘水解物体内外抗肝细胞毒性的抗凋亡作用

Dong-Ho Bak公司 1, Jungtae Na公司 1, Mi Ji Choi先生 1, Byung Chul Lee先生 1, Chang Taek噢 2, 金正勇（Jeom-Yong Kim） 2, 韩海忠（Hae Jung Han） 2, 穆俊金（Moo Joong Kim） 三, Tae Ho Kim先生 4, Beom Joon Kim先生 1
附属公司

人胎盘水解物体内外抗肝细胞毒性的抗凋亡作用

Dong-Ho Bak公司等。 国际分子医学杂志. 2018年11月.

摘要

细胞凋亡和氧化应激在急性肝衰竭和暴发性肝衰竭的发病机制中至关重要。据报道，人胎盘水解物（hPH）具有抗氧化和抗炎特性。在本研究中，研究了hPH对D‑半乳糖胺（D‑GalN）‑和脂多糖（LPS）‑诱导的肝细胞凋亡的保护作用。此外，还研究了hPH抗D‑GalN诱导的体外细胞死亡的抗凋亡活性的分子机制。雄性Sprague-Dawley大鼠在给予或不给予hPH的情况下注射D-GaIN/LPS。腹膜内注射D‑GaIN/LPS后24小时处死大鼠，收集血液和肝脏样本用于未来的炎症和肝毒性分析。在D‑GalN暴露前用hPH预处理2 h的HepG2细胞中，测定了细胞活力、凋亡蛋白表达、线粒体质量、线粒体膜电位、活性氧生成以及与保护机制相关的蛋白质和mRNA水平的变化。研究结果表明，hPH治疗通过降低丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子‑α的水平，以及增加增殖细胞核抗原的水平，有效地保护了D‑GalN/LPS‑诱导的肝细胞凋亡。还发现hPH抑制D‑GalN诱导的凋亡细胞死亡。hPH激活了抗氧化酶的表达，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶，这些抗氧化酶被Kelch‑样ECH2相关蛋白1‑p62‑核因子-红细胞样2‑相关因子2途径进一步上调，该途径是氧化应激防御机制的一个组成部分。此外，hPH通过减少损伤调节自噬调节剂、p53和C/EBP同源蛋白，显著降低了细胞溶质和线粒体活性氧物种，挽救了线粒体的丢失和功能障碍。总之，hPH通过抑制氧化应激和维持细胞内环境稳定，在肝细胞凋亡中发挥保护作用。其潜在机制可能与抑制内质网应激和最小化自噬过程有关。

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图1
图1
hPH治疗对D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭的保护作用。每隔24小时向大鼠皮下注射三次hPH（1.2、2.4或3.6 ml/kg），然后暴露于700 mg/kg D-GalN和15µg/kg LPS（D-GalN/LPS）。在D-GalN/LPS激发24小时后，对每个实验组的肝脏进行检查。（A） 肝脏的大体图像。比例尺=1 cm（B）动物重量（n=4-6）在献祭前测量；各组间无统计学差异。（C） 处死后测量肝脏重量，各组间无统计学差异（n=4-6）。（D） 观察D-GalN/LPS暴露后24 h大鼠的存活率（n=12）。在暴露于D-GalN/LPS 24小时后，从动物身上收集血清（n=4-6），以测定（E）AST、（F）ALT、（G）LDH、（h）IL-6和（I）TNF-α的水平。所有数据均表示为平均值±标准误差*P<0.05和**与D-GalN/LPS组相比，P<0.01。人胎盘水解物；D-GalN，D-半乳糖胺；脂多糖；控制；天冬氨酸转氨酶；丙氨酸氨基转移酶；乳酸脱氢酶；IL-6、白细胞介素-6；TNF-α、肿瘤坏死因子-α。
图2
图2
hPH治疗对D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭组织变性和凋亡的影响。（A） 组织病理染色。上面板（放大倍数，×20），下面板（放大倍率，×40）。比例尺=100µm。箭头表示凋亡的肝细胞（黑色），这是一个包含气球状肝细胞的小叶严重受累区域（红色），肝细胞被脂肪空泡扩张（绿色）。（B） 显示PCNA染色的图像。比例尺=100µm。（C） 采用TUNEL染色研究大鼠肝组织对D-GalN/LPS的凋亡反应。比例尺=100µm。（D） 使用四分制（0-3）对染色切片进行组织病理学分级，0、1、2和3分别表示无损伤、轻度损伤、中度损伤和重度损伤。（E） D-GalN/LPS治疗组的PCNA阳性细胞数量明显少于对照组；与单独的D-GalN/LPS治疗相比，hPH的添加导致肝中PCNA的显著过表达。（F） 与对照组相比，单独用D-GalN/LPS处理的组中TUNEL阳性细胞的数量更高。然而，在用1.2、2.4和3.6 ml/kg hPH处理的组中，D-GalN/LPS的凋亡诱导进一步减少。所有数据均表示为平均值±标准误差。*P<0.05和**与D-GalN/LPS组相比，P<0.01。人胎盘水解物；D-GalN，D-半乳糖胺；脂多糖；增殖细胞核抗原；控制。
图3
图3
hPH处理对D-GalN诱导HepG2细胞凋亡的影响。（A） 用25、50或100 mM D-GalN处理HepG2细胞24小时。与溶媒对照组相比，用50 mM D-GalN处理的细胞存活率几乎为50%。使用50 mM D-GalN的浓度来确定50%的抑制浓度。（B） 在D-GalN刺激（50 mM）之前，用hPH（5%）处理HepG2细胞2小时。24小时后，通过（C）细胞计数试剂盒-8试验和（D）乳酸脱氢酶释放试验评估hPH的肝保护作用，并使用（E）倒置相差显微镜观察形态学变化（比例尺=50µm）。在有或无5%hPH的情况下，用D-GalN（50 mM，24 h）刺激HepG2细胞。（F） 细胞接受荧光显微镜（仅PI染色）和（G）Annexin V/PI染色，用微孔板（标尺=50µm）进行分析。（H） 在每种条件下（比例尺=5µm），用DAPI染色检测DNA片段（红色箭头）和核凝聚（白色箭头）。对于western blot分析，收集细胞裂解物并进行十二烷基硫酸钠-PAGE，然后使用抗BCL2、抗BAX和抗PARP抗体进行免疫印迹分析。抗-GAPDH被用作负荷控制。（一） 代表性图像和（J）密度测定。所有数据均表示为平均值±标准误差。**与D-GalN组相比，P<0.01。人胎盘水解物；D-GalN，D-半乳糖胺；控制；乳酸脱氢酶；BCL2，B细胞淋巴瘤2；BAX，Bcl-2-相关X蛋白；聚ADP核糖聚合酶；PI，碘化丙啶。
图4
图4
通过hPH治疗，D-GalN诱导的HepG2细胞线粒体功能障碍和ROS过度生成得到改善。在有或无5%hPH的情况下，用D-GalN（50 mM，24 h）刺激HepG2细胞。（A） 用抗Tomm20抗体对hPH处理后的HepG2细胞进行免疫染色，然后添加Cy3-结合二级抗体。使用DAPI染色鉴定细胞核（比例尺=5µm）。（B） 测量线粒体质量的MitoTracker荧光信号。（C） ΔΨm是在指定条件下使用ΔΨm敏感的荧光铬MitoTracker Red CMXRos测量的。（D） 细胞用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯染色30分钟，以测量细胞内过氧化氢。（E） 细胞用MitoSOX染色30分钟以测量线粒体活性氧。条形图显示了相关分析。所有数据均表示为平均值±标准误差。**与D-GalN组相比，P<0.01。人胎盘水解物；D-GalN，D-半乳糖胺；控制；MMP/ΔΨm，线粒体膜电位；活性氧。
图5
图5
hPH处理的HepG2细胞中抗氧化酶的上调和Keap1-Nrf2的调节。（A） 用抗SOD-1、抗SOD-2、抗GPx或抗过氧化氢酶抗体对hPH诱导的HepG2细胞的裂解液进行免疫印迹。代表性图像（左侧面板）、密度测定结果（右侧面板）。所有数据均表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**与0小时时间点相比，P<0.01。（B） 用hPH处理后，通过western blot分析测定p-p62、p62、Keap1和HO-1的表达水平。代表性图像（左侧面板）、密度测定结果（右侧面板）。所有数据均表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**与0小时时间点相比，P<0.01。（C） 与未经处理的HepG2细胞相比，hPH处理的Hep G2细胞中Nrf2的核定位。用抗Nrf2、抗Lamin B1或抗GAPDH抗体对hPH处理的HepG2细胞的裂解液进行免疫印迹。代表性图像（左侧面板）、密度测定结果（右侧面板）。所有数据均表示为平均值±标准误差。*P<0.05，**与0小时时间点相比，P<0.01。（D） 用抗Nrf2抗体对hPH处理后的HepG2细胞进行免疫染色。使用DAPI染色鉴定细胞核（比例尺=20µm）。人胎盘水解物；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；Keap1，Kelch-like ECH2相关蛋白1；血红素氧化酶-1；p-p62；Nrf2，核因子-E2相关因子2。
图6
图6
hPH处理导致D-GalN刺激后HepG2细胞中自噬调节的改变。（A） 用hPH处理的HepG2细胞表现出最小的自噬流量。为了检测自噬体，用抗LC3抗体对细胞进行免疫染色。使用DAPI染色鉴定细胞核（比例尺=10µm）。（B） 用抗LC3 I/II、抗DRAM、抗CHOP、抗p53或抗GAPDH抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。典型的western blot图像（左侧）和密度测定结果（右侧）。所有数据均表示为平均值±标准误差。**与D-GalN组相比，P<0.01。（C） 通过逆转录定量聚合酶链反应分析测定内质网应激和自噬相关基因的转录水平。所有数据均表示为平均值±标准误差。**与D-GalN组相比，P<0.01。人胎盘水解物；D-GalN，D-半乳糖胺；控制；LC3，微管相关蛋白1A/1B-轻链3；损伤调节自噬调制器；CHOP、C/EBP同源蛋白；ATF，激活转录因子；BECN1；贝克林1；LAMP1，溶酶体相关膜蛋白1。
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