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.2018年8月21日;9(1):3165.
doi:10.1038/s41467-018-05613-7。

神经酰胺合成酶1的选择性抑制剂揭示了在脂肪代谢中的新作用

附属公司

神经酰胺合成酶1的选择性抑制剂揭示了在脂肪代谢中的新作用

奈杰尔·特纳等。 国家通讯社. .

摘要

由神经酰胺合成酶家族合成的特定形式的脂质神经酰胺被认为可以调节代谢生理学。基因小鼠模型已建立C16神经酰胺作为肝脏和脂肪组织中胰岛素抵抗的驱动因素。由神经酰胺合成酶1(CerS1)合成的C18神经酰胺在骨骼肌中含量丰富,可能促进人类的胰岛素抵抗。我们在此描述第一个异构体特异性神经酰胺合成酶抑制剂P053,其以纳米摩尔效力抑制CerS1。脂质组学分析表明,P053对CerS1具有高度选择性。喂食高脂肪饮食(HFD)的小鼠每天服用P053会增加骨骼肌中的脂肪酸氧化,并阻止肌肉甘油三酯和肥胖的增加,但不能防止HFD诱导的胰岛素抵抗。因此,我们的抑制剂使我们能够将CerS1定义为肌肉线粒体脂肪酸氧化的内源性抑制剂和全身肥胖的调节器。

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数字

图1
图1
P053是CerS1的选择性抑制剂。G024[1]和P053[2]的结构。b条CerS亚型活性与P053浓度的关系(n个 = 每种浓度平均值为3±SEM)。c(c),d日CerS1活性与c(c)二氢鞘氨醇或d日C18:0-CoA浓度。计算V(V)最大值K(K)一半数值在图表下方。图表显示平均值±扫描电镜(n个 = 每种浓度为3),并且在每种底物的三个独立实验中证实了非竞争性抑制
图2
图2
P053选择性降低培养细胞中的C18鞘脂。在预处理2小时的皮层神经元培养物中由氘化(D7)二氢鞘氨醇形成氘化神经酰胺h,P053。b条d日内源性神经酰胺(b条),HexCer(c(c))和SM(d日)24小时后HEK293细胞中的水平h,P053的浓度如图所示。脂质水平表示为车辆控制水平的百分比。绝对脂质水平如补充图1所示,补充数据文件1中提供了这些图像的原始数据。e(电子)72天后,通过碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术测定非存活HEK293细胞的百分比用P053治疗h。所有图表显示两个独立实验的组合数据,每个实验有3个()或4(b条d日)单独细胞处理,平均值±SEM.统计显著性(b条d日)由确定t吨-经多次比较调整后的测试,将各浓度下的所有脂质(共测试22种脂质)与对照组进行比较;+P(P) < 0.05;#P(P) < 0.01; *P(P) < 0.001
图3
图3
CerS1抑制选择性地减少SkM中的C18神经酰胺。单次5次后的血浆P053浓度mg/kg口服剂量(n个 = 5只小鼠;意思是±SEM)。b条通过定量PCR测定小鼠组织中CerS1 mRNA的表达(n个 = 3只小鼠;水平条表示平均值)。水平正常化为18S rRNA。WAT附睾白色脂肪组织,BAT棕色脂肪组织。还显示了CerS2的结果,以证明缺乏CerS1表达的组织样本中存在RNA。c(c),d日火山图显示P(P)P053处理的SkM中302种脂质中的每一种相对于媒介物处理的小鼠的倍数变化绘制的值。c(c)咀嚼饮食,d日HFD、,n个 = 每组18-20人。P053与载脂体相比,脂质显著改变,以蓝色显示并按名称标记。e(电子)单个神经酰胺水平,(f)总神经酰胺,单个SM物种,小时二氢鞘氨醇(dhSph)和鞘氨醇用媒介物或5喂食食物或HFD的小鼠的SkM中的总TAGmg/kg P053,持续4-6周(n个 = 每组18–20人;n个 = 对于dhSph和Sph,每组8-10个)。j个肝神经酰胺类(j个)、肝SM种(k个)附睾脂肪神经酰胺()附睾脂肪SM物种();n个 = 每组10人。条形图显示平均值±扫描电镜;#P(P) < 0.01; *P(P) < 0.001,由双尾确定t吨-经多次比较调整的测试(P(P)值经过多次比较调整后)。方框图和胡须图显示了完整的数据范围,其中第25-75个百分位用方框表示,水平条表示中间值。中的结果((f)), (小时)、和()通过双向方差分析,采用Fisher精确后验比较各组(+,P(P) < 0.05;#P(P) < 0.01; *P(P) < 0.001). 的原始数据e(电子),,j个,k个,在补充数据文件1中提供
图4
图4
CerS1抑制抑制喂食HFD小鼠的脂肪积累,但不影响胰岛素抵抗。总体重,b条通过回波MRI确定的脂肪质量占体重的百分比,c(c)附睾白色脂肪组织(WAT)肿块,d日腹股沟WAT质量,以及e(电子)棕色脂肪组织(BAT)质量,喂食含载体或5的食物或HFD的小鼠mg/kg P053,持续4-6周(n个 = 每组20人)。(f)空腹胰岛素和喂食含载体或5的食物或HFD的小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖毫克/千克P053(n个 = 每组10个;意思是±SEM)。小时葡萄糖输注率,循环中的葡萄糖处置率(Rd),以及j个,k个四头肌葡萄糖摄取率(Rg')(j个)和比目鱼(k个)肌肉,如在高胰岛素血症-正常血糖钳夹中确定的(n个 = 每组6-9只小鼠,详见方法)。方框图和胡须图((f))用25-75个百分位方框显示完整的数据范围,并用横条标记中间值。通过双向方差分析确定的显示饮食或药物主要影响的P值显示在每个图表下方;ns不显著。曲线下面积增量(iAUC)的方差分析结果如下()
图5
图5
CerS1抑制增加了SkM的棕榈酸酯氧化和线粒体呼吸能力。 14用P053或载体治疗6周的小鼠的SkM匀浆中的C-棕榈酸酯氧化(n个 = 10只老鼠)。b条 14C-棕榈酸酯并入TAG,以及c(c) 14用5mg/kg P053或车辆控制(n个 = 5只老鼠)。结果显示nmoles14C-棕榈酸酯转化为b条标签或c(c)合作2+酸溶性代谢物。d日预处理1.5倍比目鱼肌条中的棕榈酸酯氧化体外h,含1μM P053或车辆控制(n个 = 5只老鼠)。e(电子)用5mg/kg P053或车辆控制(n个 = 7只小鼠)。统计显著性()通过双向方差分析(图表下方报告的药物和饮食的主要影响)确定(b条e(电子))由双尾t吨-测试(结果,其中P(P) < 0.05在图表上显示)
图6
图6
CerS1抑制增加了SkM的线粒体标记。实时PCR测定SkM中线粒体(mt)和核编码呼吸复合体亚单位的水平;n个 = 饮食组9个;n个 = HFD组为10。b条SkM呼吸复合物亚单位的蛋白质印迹。c(c)呼吸复合物亚单位相对于14-3-3蛋白的密度测定。d日SkM中柠檬酸合成酶和β-羟酰辅酶A脱氢酶(βHAD)活性。b条d日,n个 = 除食物外,所有组10只小鼠 + P053组,其中n个 = 8e(电子)PGC-1α蛋白水平的Western blot,密度测定归一化为14-3-3蛋白,n个 = 每组18–20只小鼠。(f)线粒体DNA(mtDNA)含量,归一化为核DNA(nDNA),并相对于对照组的平均值进行表达;n个 = 除食物外,所有组10只小鼠 + P053组,其中n个 = 8实时PCR测定线粒体生物发生和功能调节器的基因表达水平;n个 = 8个为饮食组;n个 = HFD组为10。,显示平均值±SEM。方框图和胡须图显示了完整的数据范围,其中第25–75个百分位用方框表示,水平条表示中间值。通过双向方差分析确定统计显著性,在每个结果下面显示药物或饮食的主要影响*P(P) < 0.05; **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001. 面板的原始数据在补充数据文件1中提供
图7
图7
CerS1抑制不会影响肝脏中的线粒体标记物。呼吸复合物亚单位的蛋白印迹,b条与14-3-3蛋白相关的呼吸复合物亚单位的密度测定,以及c(c)肝匀浆中柠檬酸合成酶和βHAD活性;n个 = 每组10只小鼠。方框图和胡须图显示了完整的数据范围,其中第25–75个百分位用方框表示,水平条表示中间值。通过双向方差分析确定统计学显著性,每个结果下方显示药物或饮食的主要影响*P(P) < 0.05

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