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.2018年9月；16(3):2789-2796.
doi:10.3892/ol.2018.9036。 Epub 2018年6月28日。

重组人内皮抑素腺相关病毒基因治疗肾癌

孙二林 1, 韩瑞发 1, 冰心路 2
附属公司

重组人内皮抑素腺相关病毒基因治疗肾癌

孙二林等。 Oncol Lett公司. 2018年9月.

摘要

肾细胞癌（RCC）的特点是肿瘤发展过程中血管生成旺盛。各种治疗方法都不能完全根除肿瘤复发。本研究以血管生成为靶点，开发了含有人内皮抑素基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体，用于人肾癌基因治疗。通过皮下接种RCC细胞和肌肉内或肿瘤内注射rAAV-Endostatin，在裸鼠中建立预防和治疗RCC模型。通过肿瘤体积和重量评估异种移植瘤的生长。用微血管密度（MVD）测定rAAV-Endostatin的抗血管生成作用。还检测了rAAV-Endostatin的毒性作用。在治疗模型中，与瘤内注射rAAV-Endostatin增强黄色荧光蛋白（EYFP）的对照组（21.50±11.42）和RPMI-1640组（21.75±10.48天）相比，瘤内注射r AAV-Endomastin的荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢（32.63±9.75）三). rAAV-Endostatin处理的异种移植物的MVD为8.30±3.14/0.739 mm2而对照组为13.87±4.09/0.739 mm2（rAVV-EYFP）和13.76±3.50/0.739毫米2（RPMI-1640）。在重要器官中未发现与rAAV-endostatin使用相关的显著副作用。rAAV-Endostatin具有显著的抗血管生成和抗肿瘤活性。它可以作为肾癌基因治疗的有效药物。

关键词：血管生成；内皮抑素；基因治疗；肾癌。

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数字

图1。
图1。
rAAV-Endostatin的构建、生产和感染。（A） rAAV内皮抑素载体的构建。将内皮抑素基因插入pAAV载体的MCS中；感染rAAV-YRFP的OS-RC-2细胞。（B） 通过透射电子显微镜（放大倍率，×80000）显示肿瘤细胞中的rAAV颗粒。（C） 用ELISA法分析rAAV-Endostatin感染的OS-RC-2细胞产生内皮抑素的情况。采用方差分析比较RCC-rAAV-RYFP细胞和OS-RC-2-rAAV-endostatin细胞*P<0.05。MCS，多克隆位点；ITR，反向末端重复；腺病毒相关载体；增强型黄色荧光蛋白EYFP；ori，复制的起源。
图2。
图2。
rAAV-endostatin感染对肾癌细胞的增殖和凋亡无影响。（A） 分析感染rAAV-endostatin和rAAV-YRFP的OS-RC-2细胞的形态。两组细胞均表现出上皮样生长，无明显形态学变化（放大倍数，×400）。（B） 通过方差分析比较OS-RC-2-endostatin和OS-RC-2-YRFP细胞的增殖和（C）细胞死亡，两种细胞株之间无差异。重组腺病毒相关载体rAAV；增强黄色荧光蛋白。
图3。
图3。
rAAV-endostatin对RCC肿瘤发展的预防作用。（A） 预防性免疫模型。rAAV-endostatin有效抑制膀胱癌的发生发展。（B） 皮下接种后总共4周，接种rAAV-endostatin的OS-RC-2肿瘤发生率为50%，但对照组为100%（8/8只），肿瘤的（C）体积和（D）重量均低于对照组（通过方差分析）。重组腺病毒相关载体rAAV；增强黄色荧光蛋白*P<0.05。
图4。
图4。
rAAV-endostatin对肾癌的治疗作用。（A） 治疗模式。（B） OR-SC-2接种后共10天，瘤内rAAV-endostatin（1.0×1011v.p）或对照病毒注射到已建立的肿瘤中。注射rAAV-内皮抑素的异种移植瘤需要更长时间才能达到300mm三与对照组比较：rAAV-Endostatin组32.63±9.75天；rAAV EYFP组，21.75±10.48天；RPMI-1640组，21.50±11.42天。（C） 放大倍数×200的OS-RC-2肾肿瘤苏木精和伊红染色。给出了三个独立实验的代表性图像。（D） 采集异种移植（肾脏）肿瘤后，将标本石蜡包埋，切割成5µm厚的切片，并进行处理，以进行因子VIII相关抗原的免疫组织化学染色。棕色区域表示微血管结构（放大倍数×200）。展示了三个独立实验的代表性图像。重组腺病毒相关载体rAAV；增强黄色荧光蛋白。
图5。
图5。
rAAV-endostatin通过抑制血管生成抑制RCC肿瘤生长。（A） OS-RC-2-endostatin培养上清对人脐静脉内皮细胞趋化活性的抑制在体外; *与rAVV-EYFP相比P<0.05。（B） 注射rAAV内皮抑素（1×1011v.p），内皮抑素的血清浓度持续升高，在第60天达到峰值，此后维持在30–40 ng/ml的持续水平，表明单独使用rAAV-endostatin可能导致持续的内皮抑素表达和分泌，而这种浓度的内皮抑制素可能有效抑制肿瘤血管生成。（C） 免疫组化染色后，rAAV-Endostatin注射组移植瘤的微血管密度为8.30±3.14/0.739 mm2而对照组为13.87±4.09/0.739 mm2（rAVV-EYFP）和13.76±3.50/0.739毫米2（RPMI-1640）（n=8）。结果表明，rAAV-endostatin单次注射可能抑制肿瘤血管生成*与rAVV-EYFP或RPMI1640相比，P<0.05。重组腺病毒相关载体rAAV；增强黄色荧光蛋白。
图6。
图6。
接种rAAV-endostatin后小鼠重要器官的透射电镜和H&E分析。注射1.0×10后共8周11v.p rAAV-endostatin，采集心脏和脑组织进行安全性检查（以确保病毒感染对其他组织没有偏离靶点的影响），并且在（A）心脏组织（放大倍数，×4000；白色刻度条=2µm）或（B）脑组织（放大倍率，×4000）中均未发现不良反应；白色刻度条=2µm）。（C） 心脏、大脑、肝脏和肾脏组织的H&E染色（放大×200）在形态学上没有显示出显著变化。H&E、苏木精和曙红。
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