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.2018年8月31日；128(9):4057-4073.
doi:10.11172/JCI96400。 Epub 2018年8月20日。

内皮细胞受体稳定蛋白-2调节VWF-FVIII复合物半衰期和免疫原性

劳拉·L·斯威斯顿 1, 杰西·德赖 1, 科伦·诺特利 1, 伊琳加·乔治斯库 1, 西蒙·佩恩 1, 杰夫·梅伯恩 2, 凯特·内斯比特 1, 凯·施莱泽夫斯基 三, 西里尔·格雷德 三, 朱莉娅·克日什科夫斯卡 三, 塞尔吉·戈德 三, 威尔马·霍普曼 4, 罗伯特·蒙哥马利 5, 保拉·D·詹姆斯 6, 大卫·利利克拉普 1
附属公司

内皮细胞受体稳定蛋白-2调节VWF-FVIII复合物半衰期和免疫原性

劳拉·L·斯威斯顿等。 临床研究杂志. .

摘要

血管性血友病因子VIII（VWF-FVIII）复合体的数量异常与遗传性出血或血栓疾病相关。血浆VWF-FVIII与吞噬细胞或免疫细胞之间的受体介导的相互作用可以影响其止血和免疫活性。遗传关联研究表明，编码清道夫受体稳定蛋白-2的STAB2基因变异与血浆VWF-FVIII水平相关。然而，这种联系的机制基础和病理生理后果尚不清楚。我们已经证明，表达稳定蛋白2的细胞以VWF依赖的方式结合并内化人类VWF和FVIII，与对照组相比，缺乏稳定蛋白2小鼠显示出延长人类VWF-FVIII半衰期。在异源表达系统中，稳定蛋白-2变体p.E2377K显著降低了稳定蛋白-2的表达，并损害了VWF的内吞作用，以及与1型血管性血友病患者血浆VWF水平相关的常见稳定蛋白2变体。STAB2缺陷小鼠对人VWF-FVIII复合物的免疫原性反应降低，而人VWF-FVIII与稳定蛋白-2配体透明质酸的共融合减弱了对外源性FVIII的免疫反应。总的来说，这些数据表明，稳定蛋白2同时作为VWF-FVIII的清除和免疫调节受体发挥作用，使稳定蛋白2成为一个新的分子靶点，用于修改VWF-F VIII的半衰期和对VWF-FVIII浓缩物的免疫反应。

关键词：凝血；遗传学；血液学；内皮细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。小鼠肝脏和脾脏内皮细胞对VWF的体内摄取。
用旋转圆盘共焦显微镜实时观察包被荧光微球（绿色）与LSEC（抗CD31，蓝色）和Kupffer细胞（KCs）（抗F4/80，红色）的关联。(A类——E类)未涂层微球的活体内荧光图像(A类)，甘氨酸包被微球(B)，BSA涂层微球(C类)和VWF涂层微球(D类和E类). 比例尺：50μm。图像代表了n个=3-5个独立实验。(F类)对来自n个=3-4个独立实验±SEMt吨测试*P（P）< 0.05. 涂层微球的特性见补充图1和2以及补充视频1和2。(G公司——N个)将人pdVWF注入VWF-KO小鼠30分钟，用IHC和免疫荧光（IF）观察VWF在肝脏和脾脏的定位。图像代表了n个=3个独立实验。(G公司)使用IHC（比例尺：100μm）将人类pdVWF与小鼠肝脏细胞关联。(H（H）)通过IF（比例尺：20μm）关联LSEC（CD31，红色）和VWF（绿色）。(我)通过IF（比例尺：20μm）将人类pdVWF（绿色）与KC（F4/80，红色）关联。(J型)使用IHC将人pdVWF与小鼠脾脏中的细胞相关联（比例尺：200μm）。(K（K）)通过IHC（比例尺：20μm）关联脾内皮细胞（CD31，红色）和VWF（绿色）。(L（左）)IHC将人类pdVWF（绿色）与KC（F4/80，红色）关联。(M（M）和N个)VWF与CD31的超分辨率成像(M（M）)和F4/80(N个)（比例尺：2.5μm）。图像代表了n个=3个独立实验。对于所有图像，蓝色表示DAPI。
图2
图2。环磷酰胺诱导的LSEC细胞毒性增加VWF-FVIII的血浆水平和半衰期。
(A类——C类)用环磷酰胺处理正常C57BL/6小鼠以诱导LSEC细胞毒性，血浆VWF:Ag水平(A类)，FVIII:C版(B)，和VWFpp/VWF:Ag比率(C类)已测量(n个=每种情况10–14只动物）。(D类和E类)未经治疗的VWF-KO中输注人pdVWF（绿色）与LSEC（CD31，红色）的相关性(D类)和经环磷酰胺处理的VWF-KO(E类)老鼠。图像代表了n个=3个独立实验；比例尺：20μm。(F类)VWF、CD31和F4/80染色的定量分析n个=3个独立实验t吨测试*P（P）< 0.05. (G公司和H（H）)环磷酰胺对VWF-KO小鼠VWF半衰期的影响(n个=每种处理条件12）(G公司)和FVIII-KO小鼠的FVIII半衰期(n个=每种处理条件12）(H（H）). 半衰期研究的统计摘要见表1。
图3
图3。VWF与人肝脏和脾脏内吞内皮细胞相关。
用IF表征VWF与正常人肝细胞的相关性(A类)正常人肝脏H&E染色（比例尺：100μm）。(B和C类)血管内皮内发现VWF（绿色）(B)和正弦曲线(C类). (D类)VWF（绿色）与Kupffer细胞（CD68，红色）的关联。(E类——G公司)VWF（绿色）与LSEC标记stabilin-2的关联(E类，红色），CLEC4M(F类，红色）和CD31(G公司，红色）。(H（H）和我)VWF（绿色）与早期内体（EEA1，红色）的关联(H（H）)和晚期内体（LAMP2，红色）(我)在肝窦内。图中显示了总共n个=1个案例中的3个截面；比例尺：20μm。(J型——L（左）)VWF（绿色）与脾巨噬细胞（CD68，红色）的相关性(J型)和CD31表达（红色）(K（K）)和稳定蛋白-2表达（红色）(L（左）)脾脏中的内皮细胞（比例尺：20μm）。图中显示了总共n个=2个案例中的3个截面。对于所有图像，蓝色表示DAPI。
图4
图4。在体内和体外，表达稳定蛋白2的细胞结合并内化VWF。
(A类——F类)稳定蛋白-2和VWF在小鼠肝脏和脾脏中的影响和联系已被确定。(A类)注射人pdVWF（绿色）与VWF-KO小鼠肝脏中稳定蛋白-2表达细胞（红色）的关联（比例尺：20μm）。(B和C类)人类pdVWF（绿色）与VWF-KO中LSEC（CD31，红色）的相关性(B)和VWF/STAB2 DKO(C类)小鼠（比例尺：100μm）。(D类)注入的人类pdVWF（绿色）与小鼠脾脏中稳定蛋白-2表达细胞（红色）的关联（比例尺：20μm）。(E类和F类)VWF-KO中VWF（绿色）与脾脏内皮细胞（CD31，红色）的相关性(E类)和VWF/STAB2 DKO(F类)小鼠（比例尺：20μm）。所有图像都代表n个=3个独立实验。(G公司——L（左）)体外培养的分离VWF-KO小鼠LSEC的IF。(G公司)CD31（绿色）和稳定蛋白-2（红色）的表达。(H（H）——L（左）)如果LSEC暴露于2 U/ml VWF和/或FVIII 1小时。(H（H）)人pdVWF（hpdVWF，绿色）与表达CD31的LSEC（红色）的结合。(我——K（K）)hpdVWF的绑定(我)（正交视图插图），人重组VWF（hrVWF）(J型)，和小鼠重组VWF（mrVWF，红色）(K（K）)稳定蛋白-2表达的LSECS（红色）。(L（左）)人pdFVIII（+VWF）[hpdFVIII（+VWF）]（绿色）与稳定蛋白-2表达的LSEC（红色）的结合。比例尺：20μm。(M（M）——R（右）)转染人和鼠稳定蛋白-2 cDNA的HEK 293细胞的IF，暴露于2 U/ml VWF和/或FVIII 1小时。(M（M）和N个)hpdVWF的绑定(M（M），绿色）和hpdFVIII（+VWF）(N个，绿色）至表达人类稳定蛋白2（红色）的HEK 293细胞。(O（运行）)VWF（绿色）和FVIII（红色）在表达稳定蛋白-2的HEK 293细胞上的染色。(P（P）——R（右）)hpdVWF的绑定（绿色）(P（P）)，hrVWF（绿色）(问)和mrVWF（绿色）(R（右）)小鼠稳定蛋白-2表达（红色）HEK 293细胞。对于所有图像，蓝色表示DAPI；黄色，共定位。比例尺：20μm。所有图像都代表n个≥3个独立实验。
图5
图5。Stabilin-2缺乏会增加人类VWF-FVIII的半衰期。
(A类)在年龄匹配的正常C57BL/6小鼠和缺乏稳定蛋白（STAB2-KO）的C57BL-6小鼠中测量血浆VWF:Ag水平(n个=每种情况下26–38只动物t吨测试）。(B和C类)稳定素-2缺乏对输注人rVWF半衰期的影响(n个=每种情况下12只动物）(B)和人类pdVWF（FVIII-bound 1:1）(n个=每种情况下16只动物）(C类). (D类)使用人pdVWF（无FVIII）评估使用氯膦酸盐脂质体去除巨噬细胞和缺乏稳定蛋白-2的联合影响(n个=每种情况8只动物）。(E类)使用人pdVWF（无FVIII）评估环磷酰胺诱导的LSEC细胞毒性和稳定蛋白2缺乏的联合影响(n个=每种情况下8–16只动物）。(F类)稳定素-2缺乏对输注人pdFVIII（+VWF）半衰期的影响(n个=每种情况下16只动物），在VWF-KO中与VWF/STAB2 DKO小鼠进行比较。半衰期研究的统计摘要见表1。
图6
图6。VWF与稳定蛋白-2相互作用的遗传和生化调控。
用人稳定蛋白-2 cDNA瞬时转染HEK 293细胞，并与2 U/ml人pdVWF或2 U/ml经PNGase F预处理的人pdVVWF孵育，以去除其N-连接聚糖（de-N VWF）。(A类)去氮VWF与稳定蛋白-2表达细胞结合的定量。(B和C类)人pdVWF和去N-糖基化VWF（绿色）与人稳定蛋白-2表达（红色）细胞结合。图像代表了n个=6个独立实验。比例尺：40μm。(D类)体内研究了VWF N-连接聚糖对稳定蛋白-2清除VWF的影响(n个=每种情况下8只动物）。半衰期研究的统计摘要见表1。通过定点突变将稳定蛋白2变异体p.E2377K导入人类稳定蛋白2 cDNA。(E类和F类)将稳定蛋白-2 cDNA p.E2377K 1:1与WT瞬时转染HEK 293细胞(E类，红色）或p.E2377K稳定剂-2单独使用(F类，红色）并与2 U/ml人pdVWF（绿色）孵育。图像代表了n个=4个独立实验；比例尺：40μm。对于所有实验，蓝色表示DAPI；黄色，共定位。(G公司)VWF与表达p.E2377K稳定蛋白-2变体的HEK 293细胞结合的定量。(H（H）)p.E2377K稳定蛋白-2表达的流式细胞术分析。表2描述了稳定蛋白-2 p.E2377K变体的致病性评估。为了证明与稳定蛋白2的竞争性结合，将已知的稳定蛋白2配体与表达小鼠稳定蛋白2 HEK 293细胞预孵育15分钟，然后与2 U/ml人pdVWF孵育1小时。(我)定量IF用于比较未经处理的VWF与用稳定蛋白-2配体预处理的细胞的结合(n个=3–4个独立实验）。透明质酸；DS，硫酸皮肤素；UFH，普通肝素。在整个数据中*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001，由确定t吨测试。
图7
图7。中的常见SNVSTAB2型影响1型VWD患者血浆VWF:Ag水平。
对165例1型VWD指数病例进行了基因分型STAB2型变体rs4981022和rs12229292评估STAB2型血浆VWF:Ag和FVIII:C的遗传多样性(A类和B)之间的关联稳定2rs4981022基因型与VWF:Ag(A类)和FVIII:C(B)1型VWD患者。(C类和D类)之间的关联STAB2型rs12229292基因型与VWF:Ag(C类)和FVIII:C(D类)1型VWD患者。在整个图中，%=平均VWF:Ag或FVIII:C。患者表型数据见表3。线性回归和统计分析见表4。
图8
图8。Stabilin-2缺乏改变对人类pdVWF-FVIII的免疫反应。
(A类)正常或STAB2-KO C57BL/6小鼠每周静脉注射2 IU人FVIII（rFVIII或pdFVIII以1:2.4的比例与pdVWF复合），持续4周(n个=10（所有条件下）。在免疫激发方案中，小鼠在pdFVIII治疗的前2周接受1μg LPS静脉注射(n个= 6). 第5周，采集血液并检测抗VWF和抗FVIII IgG。(B)服用pdFVIII的小鼠中抗VWF IgG的含量（由Mann-Whitney测定单位). (C类和D类)抗-FVIII IgG发生率(C类)和滴度(D类)在接受pdFVIII的小鼠中。(E类和F类)抗-FVIII IgG发生率(E类)和滴度(F类)在接受rFVIII的小鼠中。在整个图中*P（P）<0.05，由费希尔精确试验或曼希特尼测定单位.
图9
图9。稳定素-2配体透明质酸修饰人类pdVWF-FVIII的免疫反应。
(A类)正常C57BL/6小鼠每周静脉注射2 IU人pdFVIII（以1:2.4的比例与pdVWF复合）和100μg透明质酸（HA），持续4周(n个=10（所有条件下）。第5周，采集血液并检测抗VWF和抗FVIII IgG。(B)服用含有或不含透明质酸的pdFVIII的小鼠的抗VWF IgG效价。(C类和D类)抗-FVIII IgG滴度(C类)和发病率(D类)在接受具有或不具有透明质酸的pdFVIII的小鼠中。在整个图中*P（P）< 0.05, **P（P）<0.001，由费希尔精确试验或曼希特尼测定单位.
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