Sporadic DUX4 expression in FSHD myocytes is associated with incomplete repression by the PRC2 complex and gain of H3K9 acetylation on the contracted D4Z4 allele

doi:10.1186/s13072-018-0215-z

.2018年8月20日；11(1):47.

doi:10.1186/s13072-018-0215-z。

FSHD心肌细胞中偶发的DUX4表达与PRC2复合物的不完全抑制和收缩的D4Z4等位基因上H3K9乙酰化的增加有关

Premi Haynes公司¹, 卡洛尔·博姆斯季克², 丹尼尔·米勒^3 4

附属公司

¹华盛顿大学儿科和基因组科学系，西雅图，华盛顿州，美国。
²华盛顿大学医学系，西雅图，华盛顿州，美国。
³华盛顿大学儿科和基因组科学系，西雅图，华盛顿州，美国。dgmiller.uw@gmail.com。
⁴华盛顿大学，美国华盛顿州西雅图N416室共和党街850号校园358056号信箱，邮编98109。dgmiller.uw@gmail.com。

PMID： 30122154
预防性维修识别码： PMC6100714型
内政部： 10.1186/s13072-018-0215-z

FSHD心肌细胞中偶发的DUX4表达与PRC2复合物的不完全抑制和收缩的D4Z4等位基因上H3K9乙酰化的增加有关

Premi Haynes公司等。表观遗传学染色质. 2018.

.2018年8月20日；11(1):47.

doi:10.1186/s13072-018-0215-z。

作者

Premi Haynes公司¹, 卡罗尔·博姆斯提克², 丹尼尔·米勒^3 4

附属公司

¹华盛顿大学儿科和基因组科学系，西雅图，华盛顿州，美国。
²华盛顿大学医学系，西雅图，华盛顿州，美国。
³华盛顿大学儿科和基因组科学系，西雅图，华盛顿州，美国。dgmiller.uw@gmail.com。
⁴华盛顿大学，美国华盛顿州西雅图N416室共和党街850号校园358056号信箱，邮编98109。dgmiller.uw@gmail.com。

PMID： 30122154
预防性维修识别码： PMC6100714型
内政部： 10.1186/s13072-018-0215-z

摘要

背景：面肩肱型肌营养不良症1（FSHD1）具有常染色体显性遗传模式，主要影响骨骼肌。FSHD1的遗传原因是与允许单倍型相关的4号染色体上的D4Z4等位基因的微卫星阵列收缩，导致DUX4基因的罕见零星表达。表观上，收缩的D4Z4阵列降低了胞嘧啶甲基化和开放的染色质结构。尽管存在这些遗传和表观遗传变化，但大多数FSHD成肌细胞能够抑制DUX4转录。在这项研究中，我们假设组蛋白修饰将DUX4表达和非表达细胞与相同的个体区分开来。

结果：含有允许的4qA单倍型和长末端D4Z4单位的FSHD心肌细胞被分为DUX4表达组和非表达组。我们发现FSHD影响的细胞组之间存在类似的CpG低甲基化，这表明CpG的低甲基化不足以触发DUX4的表达。一项对细胞谱系承诺期间D4Z4区域组蛋白修饰的调查显示，该区域在FSHD iPS细胞中是二价的，同时存在H3K4me3激活和H3K27me3抑制标记，使D4Z5在多能干细胞中处于激活DUX4的状态。在谱系承诺后，在FSHD和非FSHD控制的成肌细胞中，D4Z4区域与H3K27me3单价，并且在小部分细胞中伴随H3K4me3的增加。用于组蛋白修饰、染色质修饰蛋白和分类FSHD心肌细胞染色质结构蛋白的染色质免疫沉淀（ChIP）显示，在表达DUX4的FSHD肌细胞中激活H3K9Ac修饰的活性高出约四倍，而来自相同培养物的DUX4非加压FSHD心肌细胞中抑制性H3K27me3修饰的允许等位基因约高出四倍。同样，我们确定EZH2是参与H3K27甲基化的多梳抑制复合物的成员，在DUX4非压迫性FSHD心肌细胞中更频繁地出现在允许等位基因上。

结论：这些结果表明，PRC2是在FSHD和H3K9乙酰化过程中主要负责DUX4抑制的复合物，同时H3K27me3的相互缺失是导致DUX4表达的关键表观遗传事件。未来的研究侧重于触发H3K9Ac或增加小部分细胞核中PRC2复合物活性的事件，可能会暴露出其他值得研究的药物靶点。

关键词：双价；染色质；D4Z4；DUX4；营养不良；表观遗传学；FSHD；面肩胛骨；H3K9Ac；组蛋白；肌肉；神经肌肉；PRC2；多梳抑制复合体；SMCHD1。

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图1
FSHD细胞中允许等位基因的PCR扩增。一FSHD中允许等位基因的两个独特末端D4Z4连接的示意图。这两种单倍型都包含161 bp长的允许SSLP和多聚腺苷酸化信号（ATTAAA）。D4Z4阵列远端的连接不同，导致A161-L型中的3′非翻译区稍长[也称为长尾部分（LLP）]。内含子用剪接位点之间的虚线表示，外显子用黑盒子表示，较厚的部分对应DUX4蛋白的ORF。唯一识别A161-L型的PCR引物如阵列远端区域（LLP）的箭头所示。b条显示用于表征LLP引物的细胞系的基因型的表。DIR1引物与所有阵列中的一个共同区域同源，仅位于起始着丝粒。请注意，FSHD1和非FSHD对照成肌细胞系均具有允许的A161-L阵列，FSHD线中致病长度为12 kb（2次重复），对照线中疾病保护长度为74次重复）。**c（c）**从所示细胞系纯化的基因组DNA扩增的DNA片段(b条)预期结果如下所示。LLP引物的位置如所示(一)

图2
FSHD和非FSHD对照心肌细胞中DUX4表达和DUX4非按压阵列的CpG甲基化密度。CpG甲基化事件来自亚硫酸氢盐处理的非FSHD对照或FSHD影响的分化心肌细胞的分类群体。使用了唯一扩增4qA-161-L单倍型的引物，因此只显示了4qA161-L单倍型的甲基化事件。一完整D4Z4单元和终端D4Z4-部分单元（LLP）的示意图，部分全长（DUX4）或部分（DU）DUX4基因显示为黑色矩形。LLP PCR引物的位置如收敛箭头所示。b条包含单个LLP D4Z4阵列的非FSHD对照肌细胞中的CpG甲基化模式（图12081）。**c（c）**未分类FSHD影响的分化心肌细胞LLP区域的CpG甲基化模式（图12349）。d日FSHD影响的分化心肌细胞DUX4表达群体中LLP区域的CpG甲基化模式（图12349）。**e（电子）**FSHD影响的分化心肌细胞DUX4非受压细胞群LLP区域的CpG甲基化模式（图12349）。各组的CpG甲基化百分比显示在右侧。甲基化胞嘧啶的位置显示为红色方块，而非甲基化胞苷的位置则显示为蓝色方块。产生序列但不再是CpG的DNA变体为白色

图3
D4Z4基因座在人类干细胞中是二价的，在成肌细胞中变成单价的。一从H3K27me3抗体开始，然后是H3K4me3抗体，采用顺序染色质免疫沉淀法研究DUX4位点的二价性。用首先识别H3K4me3的抗体和识别H3k27me3的血清进行反向序列ChIP，也得到了类似的结果（数据未显示）。本研究使用从具有D4Z4长度镶嵌分布的个体中分离的等基因人类iPS细胞克隆。从具有非收缩（马赛克长克隆）和收缩（马赛克短克隆）iPS细胞克隆的iPS克隆中纯化的染色质用于ChIP和定量PCR扩增。干细胞二价位点（POU4F3）[25]和干细胞单价位点（HOXA3）[24，25]被用作对照，以与iPS细胞克隆中D4Z4的LLP区域进行比较。类似地，对非FSHD对照组的成肌细胞进行连续ChIP，FSHD成肌细胞再次唯一扩增这些细胞中的4qA161-L等位基因。箭头表示未检测到信号。使用Student’st吨与花叶病长克隆中的HOXA3基因座和正常原代成肌细胞中的DUX4基因座进行比较时进行测试(*第页价值 ≤ 0.05). 同样，与花叶病毒短克隆中的HOXA3基因座相比，花叶病毒短克隆中POU4F3基因座的下拉差异显著(*第页价值 ≤ 0.05).b条对ChIP-seq数据[25]进行重新处理，并与人类基因组进行比对，以进行DUX4分析。DUX4位点H3K27me3和H3K4me3的类似水平支持二价染色质结构，并与我们的ChIP结果一致(一).c（c）利用识别H3K4me3、H3K27me3、EZH2的抗体对D4Z4 DNA进行染色质免疫沉淀，并选择性扩增非FSHD对照和FSHD1成肌细胞中的允许等位基因。比较依据t吨对H3K4me3和H3K27me3非FSHD对照组与FSHD组之间归一化为H3的平均输入百分比的测试显示出统计显著性(*第页价值 ≤ 0.05). 误差条显示标准偏差

图4
DUX4表达细胞增加了H3K9乙酰化，降低了H3K27me3。一使用荧光DUX4靶报告子将来自FSHD1受影响个体的分化的肌细胞分为DUX4表达和非表达群体。使用抗抑制性（H3K9me2，H3K27me3）和激活性（H3 K4me3，H3 K9Ac）组蛋白修饰的抗体来比较来自同一培养物的DUX4表达细胞群和非表达细胞群之间修饰水平的差异。Y轴上显示归一化为H3的输入百分比。b条在允许收缩的D4Z4阵列上测量染色质修饰物EZH2（甲基化H3K27的PRC2复合物成员）、SUV39H1（参与H3K9甲基化）和结构蛋白CTCF的水平，并在表达DUX4和未表达FSHD的分化心肌细胞群中进行比较。所示值是从归一化为β-肌动蛋白的输入染色质获得的信号百分比。误差条显示6-12个重复的标准偏差。信号通过使用LLP引物对允许等位基因进行特异PCR扩增来确定（见图1）。RNA聚合酶2（Pol2）的存在与否作为阳性对照。使用进行统计比较t吨使用测试*第页价值 ≤ 0.05为显著

图5
DUX4和DUX4靶基因表达对染色质修饰剂的化学抑制反应。HDAC抑制剂RG2833的剂量增加(一)或EZH2抑制剂GSK-126(**c（c）**). 在分化开始时，用载体或指示的药物处理培养的成肌细胞。48小时后测量DUX4-reporter的荧光素酶输出，并使用CellTiterFluor的荧光信号估计细胞数量。所示为当治疗与单独载体相比时，荧光素酶输出的折叠变化归一化为细胞数。所有样品的分析一式四份。在较高的药物浓度下，荧光素酶信号减少（RG2833 25–50µM和GSK-126 20–50μM是成肌细胞融合减少的结果）。10µM浓度下RG2833的DUX4及其次级靶点CCNA1和MBD3L2的基因表达(b条)和GSK-126，浓度为10µM(d日)如图所示。RNA表达标准化为GAPDH（针对DUX4）和RnaseP（针对CCNA1和MBD3L2）作为内源性对照。所有样品的分析均一式三份。第页使用学生的t吨试验以比较溶媒和治疗组*第页 ≤ 0.05为显著

图6
激活H3K9Ac标记的增加导致小部分FSHD成肌细胞中DUX4的表达。非收缩状态下人类iPS和ES细胞的表观遗传学景观(一)并签订了合同(b条)D4Z4基因座最初是二价的，在分化为成肌细胞后变成单价的。即使在常染色质状态下，大多数具有允许的D4Z4阵列的细胞也不表达DUX4，但由于特异性激活组蛋白标记，一小部分细胞表达DUX4

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