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.2018年8月14日；24（7）：1865-1879.e9。
doi:10.1016/j.celrep.2018.07.029。

正常神经功能不需要神经元特异性TUBB3，但对轴突及时再生至关重要

阿尔班·拉特雷莫利埃 1, 龙城 2, 米歇尔·德莱尔 三, 陈武 2, Sheena Chew公司 三, 伊丽莎白·B·哈钦森 4, 安德鲁·谢里丹 5, 克洛伊·亚历山大 6, 弗雷德里克·拉特雷莫利埃 7, Shu-Hsien Sheu先生 8, 萨拉·戈利迪 9, 大村高雄 10, 埃里克·A·休伯纳 1, 范燕杰 2, 玛丽·惠特曼 11, 伊莱恩·阮 12, Crystal Hermawan水晶 13, 卡洛·皮耶保利 4, Max A Tischfield公司 2, 克利福德·J·伍尔夫 1, 伊丽莎白·C·恩格尔 14
附属公司

正常神经功能不需要神经元特异性TUBB3，但对轴突及时再生至关重要

阿尔班·拉特雷莫利埃等。 单元格代表. .

摘要

我们制作了一只神经特异性β-微管蛋白亚型Tubb3基因敲除小鼠，以研究其在神经系统形成和维持中的作用。管3-/-小鼠没有可检测到的神经行为或神经病理学缺陷，其余β-微管蛋白同型的mRNA和蛋白上调导致Tubb3中的总β-微管蛋白水平相等-/-和野生型小鼠。尽管总β-微管蛋白水平相似，但缺乏TUBB3的成年背根神经节的生长锥微管动力学降低，体内外神经突起生长率降低22%。22%的生长速度减慢对感官恢复的影响更加严重，在感官恢复中，纤维必须重新激活皮肤的全部体积，以恢复触觉功能。总的来说，这些数据表明，虽然神经系统的形成不需要TUBB3，但它在外周轴突再生速度中具有其他β-微管蛋白无法替代的特殊作用。

关键词：TUBB3；轴突生长；发展；扩散张量成像；微管动力学；小鼠；翻译后修饰；感官恢复；现场文化；微管蛋白。

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数字

图1。
图1。。管3−/−小鼠无重大解剖异常
（A） 生产Tubb3基因敲除小鼠的基因构建。老鼠被杂交Ella-cre小鼠。底部：E14.5野生型脑内TUBB3检测，管3+/−、和管3−/−鼠标，按蛋白质印迹和定量（N=9）。（B） 左：野生型和管3−/−14个月大时同窝的。中间：WT的孟德尔出生率（N=14），管3+/−（N=26），以及管3−/−小鼠（N= 15). 右图：相同小鼠在3个月大时体重增加。（C） 成年野生型和管3−/−老鼠大脑髓鞘用Luxol固蓝染色，Nissl复染。冠状前连合（左）和海马水平的切片（中）和小脑矢状切面（右）未发现胼胝体（CC）、前连合（AC）、，皮质（CX）、纹状体（St）、海马（Hi）、皮质脊髓束（CT）、外侧心室（LV）和小脑管3−/−老鼠与野生型相比。在水平上缺乏野生型视神经AC是由加工过程中的分离造成的。比例尺，400（左和中）和100 mm（右）。N=5。（D） 野生型（顶部，N=5）和管3−/−（底部，N=4）P2小鼠。Reelin（第I层）Cux-1脑切片染色（第II–IV层）、Ctip2（第V层）和Trb1（第VI层）。（E） 扩散张量成像的方向编码彩色地图成人野生型（顶部）和管3−/−（底部）小鼠检查白质束。已为生成组模板并进行比较，以确定突变模板。每个正交方向的侧面切片视图在野生型和管3−/−模板。红色，左右；绿色，背腹侧；蓝色，吻尾。CG、，扣带；PF，脑桥纤维；OT，视路；EC，外囊；芬兰，伞；其他缩写参见（C）。N=4+/+,三–/–（F）E11.5中NF-M染色颅神经和脊神经的解剖野生型和管3−/−老鼠。I–XI：相应的颅神经。每个基因型N=6。（G） 上图：坐骨神经典型的亮场横截面图像来自野生型和管3−/−老鼠甲苯胺蓝染色。比例尺，100 mm。底部：分布野生型和管3−/−老鼠。N=3。（H） 大、中、小直径有髓细胞的超微结构成人野生型和管3−/−坐骨神经。49,0003. 插图：放大显示细胞骨架MTs和神经丝。N=3。比例尺，100 nm。（一） 顶部：代表性蛋白质印迹和运动蛋白定量成人野生型和野生型坐骨神经组织裂解物中的水平管3−/−老鼠。底部：定量（n=3）。另请参见图第1章。
图2。
图2。。管3−/−小鼠没有行为缺陷
（A） 野生型和Tubb3的放射性测定/老鼠超过4天周期（N=6或6+/+, 6−/−). （B） 唤醒、非快速眼动（NREM）和快速眼动睡眠量表示为野生型和管3−/−小鼠（N= 4+/+, 4−/−). （C） 嗅觉辨别力（左），以鼻子接触的秒数为单位配上熏肉口味的软糖。通过眼动跟踪评估视力（右）化验。（嗅觉：N=8+/+, 8−/−; 视觉的视力：N=10+/+, 10−/−). （D） 在不同刺激条件下，10次刺激中快速退出的次数施加在后脚掌（左）足底表面或针刺试验（右）（N=10+/+,16−/−). （E） 在49、52和55C（左）和辐射热源（中间）。在丙酮中舔/挠的时间测试（右侧）（N=10+/+, 16−/−). （F） 平衡梁分析步骤数（第1列和第3列）和卡瓦数（第2列和第4列）（N=10+/+, 13−/−). （G） 典型复合肌肉动作电位（CMAP）记录来自野生型和野生型坐骨神经刺激诱发的植物内肌肉管道3−/−小鼠和CMAP强度和速度的量化（N=6+/+,6−/−). （H） 在可见、隐藏和反转阶段行驶的距离水-莫里斯迷宫试验（N=8+/+, 13−/−).插图：隐藏阶段所用时间的代表性热图。（I） 在中闭合/打开臂所花费时间的热图表示高架迷宫分析和定量（N=16+/+,17−/−). （J） SWA（慢波活动；0.5至4.0-Hz范围内的频谱脑电图（EEG）功率野生型（顶部）和Tubb3的前2.5小时睡眠机会/（底部）老鼠。右：NREMS SWA计算时间超过4小时（11:00–15:00）表示为24小时基线平均值的百分比（N=4+/+,4−/−). （K） 植物内注射后舔/甩爪子的时间福尔马林（1%）（N=6+/+, 6−/−). 误差条表示SEM。另请参见图S2。
图3。
图3。。管3−/−小鼠获得正常的泛管蛋白水平
（A） 代表性蛋白质印迹（左）和定量（右）成人大脑（顶部）和坐骨神经（底部）组织中的微管蛋白水平裂解物（n=3+/+, 3−/−). （B） 左侧：TUBB3耗尽实验示意图。TUBB3免疫沉淀远离成人大脑和坐骨神经（DRG/SN）组织被抗bIII微管蛋白溶解用于测定TUBB3相对总量的抗体泛-b-微管蛋白。中间：大脑中典型的西方斑点（顶部）和坐骨神经（底部）。右侧：数量（n=3+/+,三−/−). （B） 不同B-微管蛋白亚型转录物的相对比例成人大脑（顶部）和DRG（底部）中的水平管道3−/−老鼠与通过定量qPCR评估的野生型动物相比（n=6+/+, 6−/−). （C） 左图：MT聚合实验示意图。中间：代表性蛋白质印迹和使用成人的MT聚合的定量大脑（顶部）和坐骨神经（底部）组织溶解物（n=3+/+,三−/−). （D） 代表性蛋白质印迹（左）和定量（右）成人大脑（top）和坐骨神经微管蛋白翻译后修饰（底部）组织裂解物（n=3+/+, 3/). 误差条表示SEM。另请参见图S3。
图4。
图4 TUBB3对生长锥功能至关重要
（A） 斑点培养成人EB3-GFP表达的代表性图像DIV1感染pAAV-EB3-GFP的DIV6野生型DRG生长锥。EB3-GFP公司专门将生长中的MT的正端标记为彗星（绿色）；生长球果基因标记vGlu2-Tdtomato（红色）。比例尺，20μm。（B） 左：5分钟持续时间（2秒间隔）延时的代表帧成人DRG生长锥中EB3-GFP的活细胞成像使用全内反射荧光（TIRF）的DIV6野生型小鼠带有100x TIRF透镜的显微镜。右：EB3-GFP跟踪（红线）超过5分钟使用PlusTipTracker软件录制。比例尺，20μm。（B） （B）的量化。生长锥MT生长速度（左），野生型与管3−/−DRG。分析每个生长锥100-200颗彗星和每个生长锥10颗彗星实验。n=3个独立实验*p<0.05**p<0.01。ns，未配对双尾学生t检验在野生型和管3−/−鼠标用于每个条件。比例尺，20μm。（C） 左：持续1小时的最后一帧的代表性图像点培养生长锥的（间隔，1分钟）延时活细胞成像来自野生型和管3−/−老鼠在DIV6（左）上。彩色线跟踪1小时内的生长锥轨迹记录。比例尺，100 mm。中间：生长锥面积的量化。正确的：生长锥收回（R）、静止（S）和向前移动的百分比（M） ●●●●。n=6（三对野生型和Tubb3/室友，两个位置每只小鼠培养物，每培养物分析约25个生长锥）。（D） （E和F）量化（左）和直方图（右）向前移动野生型的位移（E）和距离（F）管3−/−生长（D）的锥体**未配对双尾Student’s t检验p<0.01野生型和管3−/−老鼠针对每个条件。误差条表示SEM。比例尺，100μm。
图5。
图5.轴增长呈线性，在没有TUBB3的情况下减少了20%
（A） 左：高倍镜下神经突起生长管3−/−与DIV4和DIV8的野生型斑点培养。比例尺，50 mm。右侧：Sholl分析的量化。黑色和绿色线条代表WT和管3−/−增长，分别是。n=8。比例尺，50μm。（B） 幼稚与预处理野生型生长的量化和管3−/−DRG公司多-D-赖氨酸中性底物和CSPG抑制底物上的神经元*第页< 0.05. 单向方差分析，后期Sidak的。n=12口井/口条件。（C） 分位数曲线管3−/−正常化为野生型样品的轴突生长。绿点代表神经突起每个人的增长管道3−/− 管3−/−DRG神经元通过插值计算。黑色虚线表示WT增长。虚线红色直线是Tubb3的线性回归/神经突起生长不良。n=486人神经元。误差条表示SEM。另请参见图S4。
图6。
图6缺乏TUBB3会延迟周围神经再生
（A） 坐骨神经损伤后DRG中Tubb3倍增加的qPCR时间进程压碎（n=9个/时间点）*p<0.05。单向方差分析，事后邓内特的。（B） 不同转录水平上调的倍数坐骨神经挤压后DRG中的β-微管蛋白亚型（n=6+/+,6−/−). （C） 代表性western blot（顶部）和量化（底部）α-和pan-β-微管蛋白水平的测定挤压后7天，挤压部位近端和远端的坐骨神经（n=三+/+, 3−/−). （D） MT的代表性western blot（顶部）和定量（底部）坐骨神经组织近端和远端的聚合粉碎后7天的裂解产物（n=3+/+,三−/−). （E） 代表性蛋白质印迹（顶部）和定量（底部）近端和远端聚谷氨酸化和酪氨酸化微管蛋白水平挤压后7天，听神经组织部分溶解（n=三+/+, 3−/−). （E） 坐骨神经挤压后24天内的针刺试验得分（N= 21+/+, 14−/−). *p<0.05。双向RM ANOVA，事后Sidak’s。（F） 坐骨神经挤压后24天内的刷检评分（N=9+/+, 9−/−). *p<0.05。双向RM ANOVA，事后Sidak’s（n=9）。（G） 坐骨神经挤压后脚趾在损伤前的扩展百分比（N=9+/+, 9−/−). *p<0.05。双向RM方差分析，事后Sidak的。（I–M）代表收获皮肤区域的图纸进行免疫染色处理。对小鼠进行针刺测试，评分然后取下与腓肠区相对应的皮肤，进行固定，对NF200（I）进行全山染色。成像是在12（J）、15（K）、21（L）和30从真皮到表皮（M） 坐骨神经挤压后数天。每只动物的针刺得分为显示在每张图片的右上角。得分3，黄星表示最后一个积极行为反应的位置。比例尺，500微米。误差条表示SEM。另请参见图S5。
图7。
图7功能恢复需要对加重Tubb3延迟的卷进行再神经化/老鼠
（A） 野生型和非野生型针刺反应的功能恢复管3−/−老鼠表示为在坐骨神经挤压后不同时间*p<0.05。双向RM方差分析，后期hoc Sidak的。（N=21+/+, 14−/−). （B） 针刺反应功能恢复的线性回归。在野生型小鼠，这可以预测损伤部位（y上的交叉点轴，黑点）和再生率（2.58mm/天）。在管3−/−老鼠，这种线性回归不能预测损伤部位（红点）。蓝色圆点表示野生型和管3−/−老鼠。（C） 确认受伤部位之间的距离坐骨神经挤压模型和足跟区域的开始，其中针扎测试开始（N=9+/+, 9−/−). （D） 整个mount后肢皮肤中NF-H染色的再生神经野生型和管3−/−老鼠坐骨神经挤压后（针刺评分5+7天）。染色纤维是根据其在皮肤组织中的深度而产生的假彩色。比例尺，100（左）和25 mm（右），（n=3+/+, 3−/−每个时间点）。（E） 功能恢复延迟模型管3−/−老鼠与野生型小鼠相比。实心圆表示实验点，而这些曲线是从线性增长和22%的延迟中推断出来的管3/老鼠。预计恢复20%至25%的生长缺陷与野生型相比，1D（黄色；简单平面上的长度）、2D（粉红色；生长和3D（绿色；体积增长）。红色虚线表示22%与3D野生型相比，生长缺陷；这与我们的缺陷相同体外观察。（F） 再生速度降低22%对通过针刺试验评估坐骨神经和功能恢复情况。纤维需要在后足内占据一个体量进行功能恢复加剧了管3−/−老鼠。（G） 针刺、2-G和1-G的机械敏感性时间过程野生型和管3−/−老鼠周围神经挤压后（N=9+/+；10−/−对于vF，N=8+/+；8−/−用于针刺）。测试的皮肤面积为用红点圆圈表示*p<0.05。双向RM方差分析，事后Sidak的。误差条表示SEM。
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