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.2018年9月28日；46(17):8966-8977.
doi:10.1093/nar/gky705。

人类端粒酶RNA编码的蛋白质参与细胞保护途径

玛丽亚·鲁布索娃 1 2, 尤利娅·纳雷基纳 1 三, 达里娅·瓦西尔科娃 2, 马克·梅森 三, 玛丽亚·兹维列娃 2, 弗拉基米尔·普拉索洛夫 4, 瓦西里·拉扎列夫 5, 瓦伦汀·曼努维拉 5, 谢尔盖·科瓦尔丘克 6, 尼科莱·阿尼卡诺夫 5, 伊万·布滕科 5, 奥尔加·波贝古茨 5, 瓦迪姆·戈沃伦 5, 奥尔加·顿索娃 1 2 6
附属公司

人类端粒酶RNA编码的蛋白质参与细胞保护途径

玛丽亚·鲁布索娃等。 核酸研究. .

摘要

一些研究描述了RNA中编码的功能肽，这些功能肽被认为是非编码的。端粒酶RNA与端粒酶逆转录酶和调节蛋白一起组成端粒酶复合体，是端粒长度维持机制的主要组成部分。与蛋白质亚单位相反，端粒酶RNA在大多数没有端粒酶逆转录酶的体细胞中组成性表达。我们在这里显示，人类端粒酶RNA的转录物编码121个氨基酸蛋白（hTERP）。免疫印迹、免疫荧光显微镜和质谱显示hTERP的存在。功能获得和功能丧失实验表明，hTERP保护细胞免受药物诱导的凋亡，并参与自噬体的加工。我们认为hTERP调节自噬和凋亡之间的串扰，并参与应激条件下的细胞适应。

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数字

图1。
图1。
hTERC初级转录本的编码能力。(A类)UCSC基因组浏览器揭示的hTERC周围基因组位点的结构。(B类)使用JalView对人类、猫、马和老鼠的TERP进行校准。氨基酸残基以ClustalX颜色着色。(C类)HEK293T细胞核质提取物的α-微管蛋白和组蛋白H3的Western blot分析。(D类)对HEK293T细胞核质组分制备的RNA进行hTERC和GAPDH前体和mRNA的RT-qPCR。核质组份中RNA相对于总细胞提取物中相同RNA的平均倍数变化。计算三个生物重复的平均值±SD。通过GraphPad软件计算统计显著性。(E类)从HEK293T细胞的细胞核和细胞质部分制备的RNA接受hTERC和GAPDH未片段（预）和剪接（mRNA）转录物的RT-PCR。核质和总组分的RT-PCR产物在琼脂糖凝胶中溶解RT通道表示PCR反应中的产物，在模拟反应中省略RT酶以排除DNA污染。
图2。
图2。
hTERP在端粒酶阳性细胞中表达。(A类–C类)hTERP在HEK293T（A）、Jurkat（B）和HT1080（C）细胞中的免疫定位；蓝色DAPI染色细胞核；红色，hTERP；比例尺，5μm。(D类)对HEK293T、Jurkat和HT1080细胞进行hTERP存在的Western blot分析。GAPDH染色作为负荷对照。(E类)HEK293T shLuc（表达的shRNA靶向荧光素酶mRNA（阴性对照））、HEK293C shTERC1和HEK293 T shTERC2（表达的shRNAs靶向hTERC）中的hTERC水平归一化为HEK293A细胞中的hERC水平。计算三个生物重复的平均值±SD。(F类)对HEK293T shLuc（表达的shRNA靶向荧光素酶mRNA（阴性对照））、HEK293 T shTERC1和HEK293A shTERC2（表达的shRNAs靶向hTERC）进行蛋白质印迹分析，以检测hTERP的存在。GAPDH染色作为负荷对照。
图3。
图3。
hTERC编码ORF。(A类)HEK293T和VA13细胞的hTERP存在的蛋白质印迹分析。GAPDH染色作为负荷对照。(B类和C类)hTERP在VA13（B）和HEK293T（C）中的免疫定位；蓝色DAPI染色细胞核；红色，hTERP；比例尺，10μm。(D类)VA13、VA13载体、VA13 hTERCstU、VA13 h-TERCstop、VA13 h TERCwt（VA13表达空载体或野生型或突变型hTERC）和HEK293T中的hTERC水平。计算三个生物重复的平均值±SD。(E–G公司)VA13 hTERCstU（E）、VA13 hPERCstop（F）和VA13 hERCwt（G）的免疫荧光分析（VA13细胞表达野生型或突变型hTERC）；蓝色DAPI染色细胞核；红色hTERP；比例尺，10μm。(H（H）)对VA13、VA13载体、VA13 hTERCstU、VA13 h TERCstop和VA13 hPERCwt细胞进行hTERP存在的Western blot分析。GAPDH染色作为负荷对照。
图4。
图4。
hTERP保护细胞免受药物诱导的凋亡。(A类)表达野生型hTERC的HEK293T细胞以及克隆60和71中的hTERP水平与野生型HEK293 T细胞中hTERP的水平相比较。(B类)用MTT法分析阿霉素处理后野生型HEK293T细胞和外源性表达hTERCwt或表达突变型hTERC的HEK293C细胞的活性。显示用凋亡诱导化合物处理48小时后活细胞百分比的滴定曲线。(C类)用MTT法分析阿霉素处理后野生型HEK293T细胞克隆60和71的活性。滴定曲线显示凋亡诱导化合物处理48小时后活细胞的百分比。(D类)用0.2μM阿霉素处理25 h后HEK293T细胞和外源性表达hTERCwt或hTERC突变形式的细胞的形态。左侧面板，未经处理的电池；右面板，处理过的细胞。
图5。
图5。
hTERP参与自噬调节。(A类)JalView对hTERP和p62的N末端区域进行了比对。氨基酸以ClustalX颜色着色。(B类)对HEK293T细胞和克隆71和克隆60的裂解产物进行免疫印迹，以检测LC3在正常条件下以及用10μM氯喹处理后的自噬抑制作用。(C类)LC3I到LC3II转化率的量化。LC3I到LC3II的转化率由三个独立的western blots（平均值±SEM（平均值的标准误差））测定，并通过GraphPad软件进行量化。“***”表示P（P）通过Dunett多重比较试验，<0.0001。(D类)HEK293T细胞、克隆60和克隆71在正常条件下和用10μM氯喹处理后hTERP和LC3的自噬抑制染色后的hTERP ORF改变的代表性免疫荧光图像；蓝色DAPI染色的细胞核；红色、hTERP和绿色、LC3；比例尺，5μm。
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