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.2018年8月8日；14（8）：e1007572。
doi:10.1371/journal.pgen.1007572。 eCollection 2018年8月。

异染色质和RNAi通过保护CENP-A免受泛素介导的降解而调节着丝粒

杨金浦 1, 孙思玉 1, 张舒 1, 马林·冈萨雷斯 1, 钱华东 1, 中轩池 1, 陈玉航 2, 费力 1
附属公司

异染色质和RNAi通过保护CENP-A免受泛素介导的降解而调节着丝粒

杨金浦等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

着丝粒是一个特殊的染色质结构域，在染色体分离中起着至关重要的作用。在大多数真核生物中，着丝粒被表观遗传上不同的异染色质结构域包围。异染色质已被证明对着丝粒功能有贡献，但异染色素在着丝粒规范中的确切作用仍不明确。大多数真核生物中的着丝粒，包括裂变酵母（Schizosaccharomyces pombe），是由组蛋白H3（H3）变体CENP-A表观遗传学定义的。相比之下，酿酒酵母芽殖酵母具有遗传学定义的点着丝粒。区域着丝粒和点着丝粒之间的转换被认为是着丝粒进化中最引人注目的进化事件之一。在这里，我们证明了Cse4，即芽殖酵母CENP-A同源物，可以定位于裂变酵母中的着丝粒，并部分替代裂变酵母CENP/ACnp1。但Cse4的过度表达导致其定位于异色区。Cse4在葡萄球菌中受到有效的泛素依赖性降解，其N末端结构域通过泛素化决定着丝粒分布。值得注意的是，如果没有异染色质和RNA干扰（RNAi），Cse4不能与着丝粒结合。我们表明，RNAi依赖性异染色质通过保护Cse4免受泛素依赖性降解而介导Cse4的着丝粒定位。异染色质也通过同样的机制促进天然CENP-ACnp1与着丝粒的结合。这些发现表明，防止异染色质降解CENP-A是着丝粒组装的一般机制，也为着丝粒进化提供了新的见解。

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图1
图1。在裂变酵母中，Cse4优先靶向着丝粒，并在功能上取代Cnp1。
A、，携带pREP1-CSE4-GFP的细胞被诱导24小时后显示单个GFP病灶（短）。28小时诱导（长）检测到多个病灶（通常为3-6个）。（底部）包含单个或多个焦点的单元格的百分比。OE，过度表达。B、，单一Cse4-GFP焦点与Sad1-CFP共同定位。C、，Cse4-GFP部分救援中国核电站1-136°C下的生长缺陷。将指示菌株的连续稀释液置于不含硫胺的最小培养基中。稀释度=10。D、，过度表达Cse4-GFP的细胞中的多个GFP病灶与mCherry-Swi6共定位。E类.ChIP qPCR显示Cse4-GFP在着丝粒区域的相对富集(碳纳米管3)，近中心区(otr系统)和端粒亚区(subT公司). ChIP重复三次。误差条表示SEM.*，p<0.01。F、， 就地表达Cse4-GFP的野生型细胞的染色质结合测定。异染色质突变体剂量1Δ携带GFP-Swi6用作对照（底部）。GFP-Swi6在剂量1Δ，并按预期被Triton X-100冲走。比例尺：2μm。
图2
图2。Cse4在裂变酵母中的表达水平极低。
A、，Cse4-GFP和Cnp1-GFP在抑制（顶部）和过度表达（底部）条件下的分布模式（24小时诱导）。B、，定量显示受抑制时显示单个病灶的细胞百分比（左），以及在过度表达状态下显示单个或多个GFP病灶的细胞比例（>3）（右）。C、，使用抗GFP抗体对表达指示蛋白的细胞进行蛋白质印迹分析。Tubulin被用作负荷控制。D、，携带pREP1-CSE4-GFP的细胞在含有硫胺的最小培养基中生长以抑制其表达（左）或缺乏硫胺以诱导过度表达（右）。携带空载体的野生型细胞被用作对照。E、，Cse4的过度表达导致轻微的染色体分离缺陷。将携带指示质粒的细胞置于含有15μg/ml TBZ但不含硫胺的最小培养基中。稀释度=10。Ctrl，不带TBZ的控制板。比例尺：2μm。
图3
图3。Cse4在裂变酵母中受到高效的泛素依赖性降解。
A、，表达Cnp1-GFP或Cse4-GFP的细胞的RT-PCR分析。使用从过度表达Cnp1-GFP或Cse4-GFP的细胞中提取的总RNA。使用GFP特异性引物分析Cnp1-GFP或Cse4-GFP转录本。Actin被用作内部控制。B、，在环己酰亚胺处理后的指定时间点（小时）收集的细胞裂解物用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。C、，裂变酵母蛋白酶体失活后，Cse4水平升高。野生型或地铁2-1背景在37°C下孵育4小时，并使用抗GFP抗体进行western blot分析。Tubulin被用作负荷控制。D、，分离表达指示蛋白质的细胞提取物，并分别进行TUBE下拉和反向下拉分析。对于TUBE下拉分析，用串联泛素结合实体（+TUBE）或对照银珠（-TUBE）免疫沉淀提取物，然后使用抗GFP抗体进行western blot分析。对于反向下拉分析（右侧面板），用抗GFP抗体免疫沉淀提取物，然后用泛泛素抗体进行免疫印迹分析。诱导时间：Cnp1-GFP为20小时；Cse4-GFP为24小时。
图4
图4。Cse4的N端对其分布和稳定性很重要。
A类，Cnp1领域组织示意图N个-抄送4C类（N4C）和Cse4N个-Cnp1号机组C类（4N1C）蛋白。还显示了全长Cnp1、Cse4和N末端删除的Cse4（Cse4-NΔ）。B、，过表达Cse4的分布模式N个-Cnp1号机组C类-GFP和Cnp1N个-抄送4C类-GFP。诱导时间：24小时。比例尺：2μm。C、，使用抗GFP抗体对表达指示蛋白的细胞进行蛋白质印迹分析。Tubulin被用作负荷控制。
图5
图5。异染色质保护着丝粒上的Cse4免受泛素介导的降解。
A、，Cse4-GFP输入氯丁橡胶4Δ和dcr1型诱导28小时后的Δ细胞显示出总扩散模式。（右）显示弥漫GFP信号的细胞百分比。B、， 就地染色质结合试验氯丁橡胶4Δ细胞过度表达Cse4-GFP。（左）剂量1以携带GFP-Swi6的Δ突变体作为对照。C、，Cse4-GFP在WT和氯丁橡胶424小时诱导时的Δ。D、，WT和WT中Cse4-GFP的Western blot分析氯丁橡胶4Δ. 诱导时间：28小时。E、 F、，通过TUBE分析对指示细胞的提取物进行分析。诱导时间：Cse4-GFP为24小时，Cse4-GFP为28小时氯丁橡胶4Δ.G、，Cse4-GFP在氯丁橡胶4Δ地铁2-1双突变体在37°C下培养4小时。在23°C下诱导细胞40小时，然后再切换到允许或限制温度4小时。比例尺：2μm。
图6
图6。异染色质通过阻止泛素介导的降解促进Cnp1的着丝粒靶向。
A、， 氯丁橡胶4通过杂交获得的在其天然启动子下表达Cnp1-GFP的Δ集落显示出弥漫的GFP信号或单焦点。（右）显示弥漫性GFP或单个病灶的菌落百分比和定量基于随机菌落分析。比例尺：2μm。B、，蛋白质印迹分析氯丁橡胶4表达Cnp1-GFP的Δ细胞。以WT为对照。C、，WT和氯丁橡胶4表达Cnp1-GFP的Δ细胞。D、，通过TUBE分析对指示细胞的提取物进行分析。C、 D、，诱导时间：WT为20小时，WT为22小时氯丁橡胶4Δ.
图7
图7。异染色质限制蛋白酶体进入着丝粒区域。
A、，Cnp1-GFP水平增加地铁2-1细胞在37°C下培养4小时。使用抗GFP抗体进行Western blotting。B、，蛋白酶体与着丝粒的结合在氯丁橡胶4Δ. 使用抗myc抗体对表达Mts2 myc的指示细胞进行ChIP测定。使用myc抗体的ChIP数据与IgG模拟ChIP的数据进行了标准化。碳纳米管3，着丝粒区域。n=8，误差条代表SEM。*，p<0.01。C、，模型：异染色质通过阻断泛素蛋白机械对着丝粒的通路来介导着丝粒特异性，以防止CENP-A的降解。
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