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.2018年8月2日7:e36435。
doi:10.7554/eLife.36435。

Fam60a（一种Sin3a亚单位）的缺失导致胚胎致死，并与基因启动子子集的异常甲基化有关

Ryo Nabeshima先生 1 2, 西村大村 三 4, 前田孝子 1, 清水夏目漱石 2, 高弘艾德 2, 肯塔·亚西罗 # 1, 酒井雅雄 1, 奇卡拉·梅诺 1, Mitsutaka Kadota公司 三 4, Hidetaka Shiratori公司 # 1, Shigehiro Kuraku先生 三 4, 滨田浩史 1 2
附属公司

Fam60a（一种Sin3a亚单位）的缺失导致胚胎致死，并与基因启动子子集的异常甲基化有关

Ryo Nabeshima先生等。 埃利夫. .

摘要

我们已经检查了Fam60a系列在小鼠发育过程中，一种在胚胎干细胞中高度表达的基因。Fam60a与Sin3a-Hdac转录辅压复合体的成分相互作用Fam60a系列-/-胚胎表现为内脏器官发育不全，在宫内死亡。Fam60a被招募到基因子集的启动子区域，这些基因的表达在Fam60a系列-/-胚胎。Fam60a靶基因的DNA甲基化水平Adhfe1公司在胚胎第7.5天（E）保持不变，但在胚胎第9.5天显著减少家庭60a-/-胚胎，表明DNA去甲基化在突变体中增强。全基因组DNA甲基化检测确定了几个不同的甲基化区域，这些区域在Fam60a系列-/-胚胎。我们的数据表明，Fam60a是正常胚胎发生所必需的，至少部分是由于它在特定基因启动子处调节DNA甲基化。

关键词：DNA甲基化；Sin3a；发育生物学；表观遗传学；小鼠；再生医学；干细胞；干细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

RN、ON、TM、NS、TI、KY、YS、CM、MK、HS、SK、HH未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.小鼠胚胎中Fam60a相互作用蛋白的鉴定。
(A类)在三种不同条件下从含有Fam60a:：维纳斯将转基因基因与GFP的珠偶联抗体进行免疫沉淀，这些抗体要么已经（对照）接触过，要么之前没有接触过重组GFP。然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结合到珠子的蛋白质，并通过银染色显示。非特异性结合到珠子上的蛋白质用星号表示，特异性结合的蛋白质的身份由质谱测定。用GFP抗体对珠结合蛋白进行免疫印迹（IB）分析，以检测Fam60a-Venus。(B类)E10.5 WT胚胎、未分化P19细胞或含有Fam60a:：维纳斯如图所示，用珠偶联抗Fam60a、抗GFP或对照兔免疫球蛋白G（IgG）对转基因进行免疫沉淀（IP），并用Sin3a、Hdac1和Hdac2抗体对所得沉淀进行免疫印迹分析（上面板）。核提取物（输入）以及暴露于用于免疫沉淀的抗体（Preclear）之前与珠非特异性结合的材料也进行免疫印迹分析。或者，用Sin3a、Hdac1、Hdac2或FLAG表位（对照）抗体对E10.5 WT胚胎的核提取物进行免疫沉淀，并用Fam60a抗体对所得沉淀进行免疫印迹分析（下表）。另请参见图3——图补充1至3。
图1——图补充1。
图1——图补充1Fam60a:：维纳斯转基因编码一种功能性Fam60a蛋白。
(A类)代表Fam60a:：维纳斯BAC转基因。指示了用于Southern杂交的探针的位置。(B类)成年小鼠WT和βgeo等位基因的基因分型Fam60a系列以及Fam60a:：维纳斯通过Southern blot分析EcoRI消化尾基因组DNA的转基因(A类). (C类)成年小鼠基因型(B类). 小鼠3和5，其基因型为Fam60a系列βgeo/βgeo并窝藏了Fam60a:：维纳斯BAC转基因未显示发育缺陷。
图1—图补充2。
图1补充图2。Fam60a和Fam60a-Venus在P19细胞和小鼠胚胎中的免疫荧光定位。
(A类和B类)未分化P19细胞Fam60a的免疫荧光染色(A类)以及通过暴露于维甲酸（1.0µM）8天诱导分化的P19细胞(B类). 荧光图像叠加在Nomarski光学图像上。比例尺，50μm。(C类)携带GFP抗体的E9.5胚胎Fam60a-Venus的免疫荧光染色Fam60a:：维纳斯转基因。细胞核也用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。上面板显示了SHF水平的横向冷冻切片，下面板以更高的放大率显示SHF。Fam60a-Venus蛋白定位于细胞核而非核仁。比例尺，100µm（上部面板）和10µ米（下部面板）。
图1-图补充3。
图1-图补充3：在缺少Fam60a的情况下，Sin3a-Hdac杂岩的形成。
核提取物制备自家庭60aflox/–和Fam60a系列–/–用Sin3a抗体对ES细胞进行免疫沉淀，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对沉淀进行分离，并用银染色（左图）。该凝胶还接受免疫印迹分析，并带有针对所示蛋白质的抗体（右侧面板）。
图2。
图2.的表达式Fam60a系列在胚胎和成年小鼠肠道中。
(A–C)原位杂交分析Fam60a系列E15.5在小鼠胚胎肠切片中的表达(A类)和E17.5(B类和C类).Fam60a系列在E15.5在胃肠道上皮细胞中表达，在E17.5在肠绒毛间表达。中图像的放大倍数更高的视图(B类)如所示(C类). 比例尺，100µm。(D–F型)成人十二指肠Fam60a表达的免疫组织化学分析。对一只野生型小鼠进行染色，并将其作为对照，但不含初级抗体(D类)或带有Fam60a抗体(E类)对于一只窝藏着Fam60a:：维纳斯用GFP抗体进行转基因(F类). 比例尺，100µm。(G–I型)LacZ的谱系痕迹分析+在注射三苯氧胺（6 mg）后的第1、3或5天，分别在含有Fam60a-CreERT2系列转基因和拉奇报告基因。比例尺，500µm。另请参见图1-图补充1。
图2——图补充1。
图2-图补充1Fam60a系列植入后小鼠胚胎。
(A类)切片原位杂交分析Fam60a系列E9.5胚胎中的表达。(B–E)端脑的高倍视图(B类)，神经管(C类)，心脏导管(D类)和体节(E类)胚胎的(A类). 比例尺，200µm。(F–H（飞行高度）)原位杂交分析Fam60a系列E12.5小鼠胚胎切片中的表达。Fam60a系列在神经管（nt）、肺中高度表达(我)，胰腺(第页)中肠上皮细胞（mg）。比例尺，1 mm。
图3。
图3……内脏器官生长迟缓Fam60a系列–/–老鼠。
(A–C)WT的整个胚胎和指示器官(Fam60a系列+/+, (A类)和Fam60a系列–/–(B类和C类)E13.5小鼠。比例尺，1 mm(D–F型)WT心脏部分(D类)或Fam60a系列–/–(E类和F类)胚胎E13.5用苏木精-伊红染色。突变胚胎表现为室间隔缺损（红色箭头）。比例尺，500µm。(G公司)的表达式Fam60a系列用全原位杂交技术检测E13.5心脏。(小时和我)Fam60a系列–/–和WT胚胎分别在E9.5。突变胚胎表现出整体生长迟缓，流出道缩短（红条）和严重的神经管缺陷。比例尺，1 mm。另请参阅图3-图补充1至4和补充文件1。
图3——图补充1。
图3-图补充1.生成Fam60a系列突变小鼠。
(A类)生成的策略Fam60a系列突变等位基因。数字框表示Fam60a系列外显子。三种PCR引物用于基因分型的位置Fam60a系列显示了等位基因（Fam60a-5A、Fam60a-3A、Fam 60a-3C）。(B类)基于PCR的基因分型Fam60a系列所示胚胎中的等位基因Fam60a系列基因型。空（–）和WT（+）等位基因分别产生417和232 bp的产物。(C类)RT-qPCR分析Fam60a系列WT中的mRNA（+/+）和Fam60a系列–/–（–/–）胚胎。数据为每个基因型四个胚胎的平均值±标准差。(D类)WT和WT中Fam60a（箭头）和α-微管蛋白（负荷控制）的免疫印迹分析Fam60a系列–/–胚胎。
图3——图补充2。
图3-图补充2Fam60a系列-/-胚胎在E18.5。
(A类)重量(Fam60a系列+/+)和Fam60a系列–/–胚胎在E18.5。突变胚比野生胚小。比例尺，1毫米(B–I类)WT内脏器官的形态学(B、 D、F、H)和Fam60a系列–/–(C、 E、G、I)胚胎在E18.5。心脏正面图显示主动脉（ao）和肺动脉（pa）在突变胚胎中平行定位(B类和C类). 肺的右侧视图显示突变体（箭头）的肺分叶不完整(D类和E类). 脾脏左侧视图显示突变胚胎（箭头）严重发育不全(F类和G公司). 左侧(小时)和正面(我)肠道视图显示，突变株的十二指肠-结肠交叉异常。比例尺，1 mm(J–M公司)WT（J和K）心脏苏木精-伊红染色切片和家庭60a–/–(L（左）和M（M）)胚胎在E18.5。在WT胚胎中，主动脉（ao）与左心室（LV）相连，而肺动脉（pa）与右心室（RV）相连。然而，在变异株中，主动脉和肺动脉与右心室相连，形成双出口右心室。此外，变异心脏明显存在室间隔缺损（箭头）。比例尺，1 mm。
图3——补充图3。
图3-图补充件3Fam60a系列–/–老鼠。
WT和Fam60a系列βgeo/βgeoE18.5处的胚胎显示在左侧，箭头表示升结肠和降结肠。右侧显示了相应的肠道图。在WT胚胎中，升结肠（图中蓝色）位于肠的腹侧（图中绿色），而在突变胚胎中，它位于背侧。比例尺，1 mm。
图3——图补充4。
图3-图补充4..BrdU免疫组织化学法测定细胞增殖指数Fam60a系列–/–和WT胚胎。
(A–H)次级心脏场（SHF）(A类和B类)，心外膜前（PE）(C类和D类)，心室（V）(E类和F类)和横隔（ST）(G公司和小时)WT的(A、 C、E、G)和家庭60a–/–(B、 D、F、H)在子宫内E9.0至E9.5处标记BrdU的胚胎被切片并用BrdU抗体染色。中的图像(A类)通过(D类), (G公司)、和(小时)以更高的放大倍数显示(A’)通过(D’), (G’)、和(小时)分别是。比例尺，100µm。(我)通过BrdU标记确定WT（开放栏）或Fam60a系列–/–E9.0到E9.5的（封闭栏）胚胎(A类)通过(小时). NT，神经管。数据为五个胚胎的平均值±标准差*p<0.05，**p<0.01（学生未成对t吨测试）。
图4。
图4.中改变的基因表达谱Fam60a系列–/–胚胎。
(A类)维恩图显示了通过ChIP-seq分析确定的Fam60a靶基因与表达上调或下调的基因之间的重叠Fam60a系列–/–RNA-seq分析显示E9.5的胚胎。(B类)E9.5中差异表达基因RNA-seq值的折叠变化Fam60a系列–/–ChIP-seq分析还发现，它们与TSS区域的Fam60a-Venus结合。数据为三个胚胎的平均值±标准差。(C类)通过RT-qPCR分析验证E9.5 WT和Fam60a系列–/–胚胎。数据为五个独立实验的平均值±标准差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001（学生未配对t吨测试）。另请参见图4图补充1和2。
图4——图补充1。
图4-图补充1.中差异表达基因的基因本体分析家庭60a–/–E9.5时的胚胎。
京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径，前10名和前5名富集分数（–log10（ρ-值））分别表示上调基因（红色条）和下调基因（绿色条）。每个条的长度代表了丰富的意义。
图4——图补充2。
图4补充图2。小鼠ES细胞中Fam60a靶基因启动子区的表达谱以及AcH3K9沉积和Tet1募集。
(A类)相控显微镜显示Fam60a系列flox/–和家庭60a–/–ES细胞。比例尺，100µm。(B类)Fam60a靶基因mRNA的RT-qPCR分析Fam60a系列flox/–和Fam60a系列–/–ES细胞。数据为五个独立实验的平均值±标准差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001（学生未成对t吨测试）。(C类)在Fam60a靶基因启动子区对AcH3K9的ChIP-qPCR分析Fam60a系列flox/–和Fam60a系列–/–ES细胞。数据以输入的百分比表示，为四个独立实验的平均值±标准差*p<0.05，**p<0.01（学生未成对t吨测试）。(D类)对Fam60a靶基因启动子区Tet1募集的ChIP-qPCR分析Fam60a系列flox/–和Fam60a系列–/–ES细胞。用针对Tet1的抗体或用对照IgG进行免疫沉淀。数据为三个独立实验的平均值±标准差。
图5。
图5 Fam60a对基因启动子的全基因组定位。
(A类)通过对带有GFP抗体的E9.5转基因胚胎进行ChIP-seq分析，确定了所有基因TSS区域Fam60a-Venus的平均结合谱，以及结合峰。距离表示为相对于TSS的距离。(B类)ChIP-seq分析的峰值分布如(A类). 约80%的峰位于基因位点。UTR，未翻译区域。(C类)Venn图显示两个独立的ChIP-seq分析的Fam60a靶基因重叠（那些结合峰在TSS的±3 kb内）（ChIP-seq1和ChIP-se_q2）。(D类)用ChIP-qPCR分析Fam60a-Venus和Sin3a分别与E9.5转基因和WT胚胎中所示基因的TSS区结合。淡蓝色和橙色条分别代表针对GFP和Sin3a的抗体的IgG对照。数据以输入百分比表示，三个独立实验的平均值±标准差。行动作为阳性对照进行检查。(E类)E9.5的Fam60a-Venus ChIP-seq结果示例Fam60a-维纳斯胚胎。ChIP-seq1和ChIP-seq2均使用GFP抗体进行检测。显示了四个Fam60a靶基因在TSS周围的峰值，红色箭头指示转录方向。另请参见图5图补遗1和2。
图5——图补充1。
图5补充了图1。Fam60a在基因启动子中的全基因组定位。
(A类)Fam60a-Venus在所有基因TSS区域的平均结合谱，结合峰由ChIP-seq2确定。距离表示为相对于TSS的距离。(B类)ChIP-seq2分析的峰值分布（左面板）与小鼠基因组的总体组成（右面板）相比较。(C类)E10.5制备的核提取物Fam60a金星将带有RIPA缓冲液或缓冲液C的转基因胚胎用GFP抗体或对照IgG抗体进行免疫沉淀，所得沉淀用Ing2抗体进行免疫印迹分析。
图5——图补充2。
图5补充图2.Fam60a靶基因启动子处AcH3K9的ChIP-qPCR分析。
E9.5重量和家庭60a–/–用AcH3K9抗体对胚胎进行ChIP-qPCR分析。数据以输入百分比表示，四个独立实验的平均值±标准差。对照IgG的值基本上为0%，因此未显示。
图6。
图6 Fam60a和Tet1之间的系统发育和功能关系。
(A类)Fam60a及其相关蛋白的分子系统发育。该树是用最大似然法和99个氨基酸残基推断出来的。引导值显示在各个节点上。(B类)Fam60、Sin3、Tet和Dnmt家族的基因库。黑框表示存在至少一个系统发育验证的直向同源物，而白框表示不存在直向同源物。2R-WGD，两轮全基因组复制。根据现有知识，还显示了单个物种中DNA甲基化的存在或不存在（铃木和伯德，2008；泽马赫和齐尔伯曼，2010）。(C类和D类)Fam60a抑制NIH3T3细胞中的Tet1活性。对表达FLAG-Tet1和Fam60a的NIH3T3细胞进行5hmC和FLAG-Tet1免疫荧光染色(C类)或独自一人(D类). 通过强力霉素诱导FLAG-Tet1表达24小时后，对细胞进行分析。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。红色箭头表示5hmC和FLAG免疫反应阳性的细胞。白色箭头表示FLAG为阳性，5hmC为阴性。(E类)在表达FLAG-Tet1的细胞中，5hmC与FLAG-Tet1的平均荧光强度图，如(C类)和(D类). (F类)FLAG-Tet1比例+在类似于(C类)和(D类). 数据为三个独立实验的平均值±标准差*p<0.05（学生未成对t吨测试）。另请参见图6图补遗1和2。
图6——图补充1。
图6补充1。Clustal OMEGA对Fam60a蛋白预测氨基酸序列的比对。
星号、冒号和周期分别表示具有完全保守残数的位置、高度相似性质的守恒和弱相似性质的守恒。保存的疏水残留物(A、 V、F、P、M、I、L、W)以红色酸性残留物显示(D、 E类)蓝色，基本残留物(R、 K)品红、羟基、巯基或含胺残留物(S、 T、Y、H、C、N、G、Q)绿色。
图6——图补充2。
图6补充图2。NIH3T3细胞中Fam60a和Venus表达以及FLAG-Tet1诱导表达的实验策略。
(A类)图6C-F所示实验中细胞转染和多西环素（DOX）诱导FLAG-Tet1表达的示意图。(B类)转染并诱导表达FLAG-Tet1的细胞的免疫荧光（IF）染色A类). 在给予强力霉素24小时后，用Fam60a和FLAG抗体进行染色。细胞核用DAPI染色。比例尺，50µm。
图7。
图7.甲基化状态Adhfe1公司WT和Fam60a系列–/–小鼠胚胎。
(A类)甲基化模式Adhfe1公司代表WT和Fam60a系列–/–亚硫酸氢盐测序显示处于指定发育阶段的胚胎。闭环和开环分别表示甲基化和非甲基化CpG位点。箭头表示的TSSAdhfe1公司. (B类)甲基化频率Adhfe1公司启动子被确定为(A类)对于每个基因型在每个发育阶段的三个或四个单独胚胎。p值是用Student的unpartiedt吨测试。另请参见图7——图补充1至图3。
图7——图补充1。
图7补充图1。Fam60a靶基因启动子的亚硫酸氢盐测序。
甲基化状态纳克(A类)和长度9(B类)在单个WT和Fam60a系列–/–E9.5时的胚胎。
图7——图补充2。
图7补充图2。E9.5 WT胚胎中hMeDIP分析揭示的Fam60a靶基因启动子处5hmC的沉积。
数据以输入百分比表示，四个独立实验的平均值±标准差。
图7——图补充3。
图7补充图3。通过亚硫酸氢盐测序确定的印迹控制区域的甲基化状态。
的印迹控制区（ICR）的甲基化状态Kcnq1其他1(A类)和桩号3(B类)在单个WT中确定Fam60a系列–/–E9.5时的胚胎。
图8。
图8.中的不同甲基化区域（DMR）Fam60a系列–/–胚胎。
(A类和B类)前500个高甲基化和低甲基化DMR在各种基因组特征中的分布。(C类和D类)前500个高甲基化和低甲基化DMR相对于最近TSS的基因组位置概况。请注意，总数超过500，因为DMR附近的两条绞线上的TSS都已计算在内。另请参见图8——图补充1和2以及补充文件2。
图8——图补充1。
图8-图补充1Fam60a系列–/–E9.5时的WT胚胎。
基于甲基化谱相似性的样本层次聚类分析树状图。
图8——图补充2。
图8补充了2。Fam60a-bound启动子上DNA甲基化水平的热图。
野生型和Fam60a系列-/-胚胎。Fam60a-bound启动子区被定义为Fam60a ChIP-seq峰值上游5kb和下游5kb之间的10kb区域。对于每个CpG的甲基化值，使用三倍的平均值。热图由Bioconductor封装的EnrichedHeatmap（Gu等人，2018）绘制，参数如下：箱大小=50 bp，平均模式=绝对，平滑=开。热图的中心表示从ChIP-seq实验中获得的Fam60a结合区的峰值。含有低甲基化CpG的区域以蓝色显示。热图上方的线条图总结了DNA甲基化的富集。请注意，大多数Fam60a结合的启动子区域是低甲基化的，野生型和Fam60a系列-/-胚胎。
图8——图补充3。
图8补充图3.高甲基化和低甲基化DMR中DNA甲基化的平均变化。
高甲基化和低甲基化DMR的甲基化变化Fam60a系列-/-胚胎用方框图表示。高甲基化和低甲基化DMR的DNA甲基化平均变化分别为11.87和10.99%。
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