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.2018年8月1日；8(1):11532.
doi:10.1038/s41598-018-30011-w。

白血病抑制因子受体在产前睾丸发育中是不必要的，但在小鼠正常精子发生的支持细胞中是必需的

迈克尔·柯利 1, 劳拉·米尔恩 1, 莎拉·史密斯 1, 尼娜·阿塔纳索娃 2, 黛安·瑞波塞特 1, 安娜卢西娅·达尔贝 1, 帕特里克·W·F·哈多克 3, 萨拉·威尔斯 4, 李·史密斯 5 6
附属公司

白血病抑制因子受体在产前睾丸发育中是不必要的，但在小鼠正常精子发生的支持细胞中是必需的

迈克尔·柯利等。 科学代表. .

摘要

白血病抑制因子（LIF）是一种属于白细胞介素-6家族的多效性细胞因子，最常被注意到的是它在维持干细胞增殖和分化之间的平衡方面的作用。在啮齿类动物中，LIF在胎儿和成人睾丸中均表达；肾小管周围肌样细胞（PTM）被认为是主要的生产场所。鉴于其解剖位置，PTM细胞产生的LIF可能同时作用于小管内和间质细胞，分别影响精子发生和类固醇生成。事实上，白血病抑制因子受体（LIFR）在生殖细胞、支持细胞、Leydig细胞、PTM细胞和睾丸巨噬细胞中表达，表明LIF信号可能是睾丸功能的关键旁分泌调节器。然而，睾丸LIFR信号在体内的确切作用尚未确定。为此，我们生成并表征了生殖细胞、支持细胞或两者中缺乏LIFR的小鼠的睾丸表型，以确定LIFR信号在睾丸发育/功能中的作用。我们的分析表明，LIFR在生殖细胞中对正常精子发生是不可或缺的。然而，支持细胞LIFR消融导致退化表型，其特征是生殖细胞异常丢失、精子停滞、生精小管扩张以及随后的生精小管萎缩。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
验证Lifr公司-敲除等位基因。（A）WT和KO等位基因示意图，详细说明基因分型引物的位置和预期PCR产物大小。（B）对从新生小鼠尾部活检中分离的基因组DNA进行代表性PCR分析，确定野生型（WT）、杂合型（HET）和纯合型（KO）动物。（C）新生儿脑组织匀浆的Western blot分析证实，LIFR蛋白在KO动物中的表达被消除。Tubulin-alpha（TUBA）被用作负荷控制。LIFR和TUBA条带都是从单个凝胶印迹图像中裁剪出来的，该图像包含在补充材料中，裁剪区域突出显示。（D）基于断奶时收集的耳环活检分离DNA的基因组PCR，杂合交配后代的转基因遗传。齐方分析显示与预期孟德尔比率存在显著偏差(X（X）2;第页 < 0.0001).
图2
图2
产前睾丸发育不需要LIFR信号。（A）出生后第0天，WT、HET和KO小鼠的代表性H&E染色睾丸切片。睾丸形态正常，生精索完整，含丰富精原细胞。n个 = 3–5，刻度 = 100 微米。（B）HSD3b（品红）、SOX9（绿色）和DDX4（金）免疫染色分别证实存在胎儿Leydig细胞、Sertoli细胞和精原细胞。WT、HET和KO睾丸之间无明显差异。插入 = 一级抗体阴性对照。n个 = 3–5，刻度 = 50 微米。
图3
图3
生殖细胞和Sertoli细胞特异性的产生Lifr公司-KO小鼠。（A）条件的示意图Lifr公司等位基因，详细说明用于检测Cre介导重组的PCR引物的位置以及PCR产物的预期大小。生殖细胞和支持细胞Lifr公司-按照材料和方法的描述生成敲除小鼠。杂合子睾丸基因组DNA的代表性PCR分析Stra8-Cre系列−/−;Lifr公司重量/tmc和Stra8-Cre系列+/−;Lifr公司重量/tmc （B）和Amh-Cre公司−/−;Lifr公司重量/tmc和Amh-Cre公司+/−;Lifr公司重量/tmc （C）小鼠证实条件基因重组Lifr公司Cre暴露的等位基因。睾丸cDNA的代表性PCR分析Stra8-Cre系列−/−;Lifr公司重量/tmc和Stra8-Cre系列+/−;Lifr公司重量/tmc （D）和Amh-Cre公司−/−;Lifr公司重量/tmc和阿姆克里+/−;Lifr公司重量/tmc （E）小鼠确认Lifr公司信使核糖核酸在生殖细胞和支持细胞中表达，Cre介导的gDNA重组后突变转录物的存在证明了这一点。具有代表性的全睾丸蛋白提取物的蛋白质印迹分析Stra8-Cre系列−/−;Lifr公司tm1c/tm1c（重量）和Stra8-Cre系列+/−;Lifr公司tm1c/tm1c（GC-KO）（F）和Amh-Cre公司−/−;Lifr公司tm1c/tm1c（重量）和Amh-Cre公司+/−;Lifr公司tm1c/tm1c（SC-KO）（G）老鼠。只有在以下情况下才能观察到睾丸LIFR蛋白的显著降低Lifr公司支持细胞（SC-KO；未配对t吨-测试；第页 = 0.001). 对于GC-KO和SC-KO印迹，LIFR和TUBA条带都是从单凝胶印迹图像中裁剪出来的，这些图像包含在补充材料中，裁剪区域突出显示。Tubulin-alpha（TUBA）被用作负荷控制。值表示为平均值 ± n的S.E.M = 每个基因型7个样本。
图4
图4
GC-KO小鼠睾丸形态正常。（A）直到d270（未配对），WT和GC-KO小鼠的睾丸重量没有差异t吨-测试）。值表示为平均值 ± n的S.E.M = ≥每年龄/基因型10只小鼠。（B）第180天WT和GC-KO睾丸的代表性H&E染色。WT和GC-KO小鼠的睾丸形态没有差异。装货单 = 生精小管、鳞片 = 1 顶板为mm，100 底板厚度为µm。（C）对附睾尾部的代表性H&E分析证实，WT和GC-KO小鼠都存在形态成熟的精子细胞。比例 = 100 微米。
图5
图5
SC-KO小鼠睾丸重量改变。在第35天，SC-KO动物的睾丸重量显著下降（未配对t吨-测试；第页 = 0.0028，牛顿 = 7–9). 在第50天，WT和SC-KO动物的睾丸重量相似（未配对t检验；p = 0.1129，牛顿 = 9). 在第100天，SC-KO小鼠的睾丸重量轻微但显著增加（未配对t吨-测试；0.0354，牛顿 = 13). 在d180时，这一增加变得更加夸张（曼希特尼U型-测试；第页 = 0.0027; n个 = 12–16). 到了d270，SC-KO小鼠的睾丸重量显著下降（未配对t吨-测试；第页 = 0.0195; n个 = 9–11). 数值表示为平均值 ± S.E.M.公司。
图6
图6
在SC-KO小鼠中观察到进行性睾丸退化表型。（A）WT（顶部）和SC-KO睾丸（底部）的代表性H&E染色达d270。SC-KO到第100天的睾丸组织学基本正常，尽管偶尔观察到生殖细胞脱落的迹象（箭头所示）。在第180天，SC-KO睾丸中观察到生精上皮广泛变性。虽然d180 SC-KO睾丸中存在形态正常的小管，但大部分小管扩张，生精上皮空泡化（星号）。（B）在第180天，WT和SC-KO小鼠的附睾尾均存在形态成熟的精子细胞。（C）整个SC-KO睾丸的连续切片显示，肾小管部分的脱落生殖细胞/细胞碎片（星号）浓度增加，精子明显停滞（箭头所示）。比例尺 = 100 微米。
图7
图7
SC-KO睾丸中支持细胞和精原细胞体积减少。（A）精原细胞的qRT-PCR分析(Stra8系列)，精母细胞(第11期)和精子(Tpn1型)特异性mRNA。在第180天，WT和SC-KO睾丸的表达水平相似（未配对t吨-测试，n = 9–10).（B）体视学分析显示，SC-KO睾丸中支持细胞和精原细胞的绝对核体积在d180时减少（未配对t吨-测试；第页 = 分别为0.0172和0.0325；n个 = 7). SC-KO睾丸中的精原细胞/支持细胞比率保持不变（未配对t吨-测试，n = 7).（C）在第180天对WT和SC-KO睾丸中活化的CASP3（棕色）进行代表性免疫染色，作为细胞凋亡的标志。WT和SC-KO睾丸（未配对）之间的CASP3阳性小管或小管基底部衬里的CASP3-阳性细胞数量（黑色箭头，高倍镜插图）没有差异t吨-测试；n个 = 5–6). 在SC-KO动物的生精上皮（开放箭头）中偶尔观察到CASP3免疫反应。包括初级抗体阴性对照和实验诱导的支持细胞死亡阳性对照。比例尺 = 100 微米。（D）mRNA表达Gdnf，Cyp26b1和基特尔WT和SC-KO睾丸之间相似（未配对t吨-测试，n = 9–10). 所有值均表示为平均值 ± S.E.M.公司。
图8
图8
SC-KO小鼠的血-睾丸屏障功能仍然有效。（A）注射到睾丸间质的生物素示踪剂仅限于生精小管（ST）之间的间质室，证实SC-KO小鼠在d180时血液-试验屏障保持完整。比例尺 = 100 微米。（B）血测试屏障相关mRNA的表达奥克顿,氯化物3或第11类SC-KO睾丸在d180时未发生变化（未配对t吨-测试；n个 = 9–10). 值表示为平均值 ± S.E.M.公司。
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