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.2018年7月30日；8(1):11438.
doi:10.1038/s41598-018-29531-2。

新生生物素介导的纤连蛋白转换需要LRP1

娜塔莎·玛丽·艾琳·博尔 1, 摩根·坎贝尔·亨特 1, 阿德里安·莱斯利·埃德金斯 2
附属公司

新生霉素介导的纤维连接蛋白周转需要LRP1

娜塔莎·玛丽·艾琳·博尔等。 科学代表. .

勘误表in

摘要

纤连蛋白（FN）在细胞外基质（ECM）的稳定性和组织中起着重要作用。我们之前已经证明FN与Hsp90直接相互作用，并且表明Hsp90抑制剂新生霉素通过受体介导的过程导致FN的转换。然而，之前还没有确定涉及的受体。LRP1是一种普遍存在的受体，负责结合Hsp90和FN的许多配体的内化，因此我们研究LRP1是否参与新生霉素介导的FN转换。FN、LRP1和Hsp90可以在一个常见的复合物中分离，新生霉素对Hsp90的抑制增加了FN和LRP1的共定位。新生霉素诱导FN增加（低浓度），随后FN丢失，主要来源于细胞外基质相关FN，并导致细胞内FN的伴随增加。新生霉素的作用对LRP1表达细胞是特异性的，可被LRP1阻断抗体和变构C末端Hsp90抑制剂SM253（而非N末端抑制剂格尔德霉素）重复。总之，这些数据表明，新生霉素抑制Hsp90后，FN的转换需要LRP1，在C末端Hsp90抑制用于治疗的情况下，这可能会产生意想不到的生理后果。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
用NOV处理Hs578T细胞导致FN基质丢失，FN基质部分被外源性Hsp90β挽救。Hs578T细胞未经治疗或用新生霉素（NOV；250或500）预处理 μM）用于1 然后添加含有外源性无内毒素Hsp90β（+Hsp90？；100）的培养基 ng/ml）或不含（−Hsp90β）或含外源性无内毒素BSA（+BSA；100 ng/ml）过夜。使用小鼠抗人FN和驴抗鼠DyLight®488二级抗体对固定细胞进行染色。细胞核用Hoechst 33342（1 μg/ml）。使用蔡司LSM 510 Meta激光扫描共聚焦显微镜拍摄图像。使用Zen软件蓝色版（德国蔡司）对图像进行分析。比例尺相当于20μm。每帧顶部的值（白色）代表每个核的平均灰度值 ± 标准偏差（n = 3） 每次治疗。使用单向方差分析和Tukey Post检验比较平均灰度值。NOV处理的平均灰度值（NOV；250或500 μM）与两个阴性对照（−Hsp90β和+BSA）的未处理细胞进行比较。将外源性Hsp90β（+Hsp90？）处理细胞的平均灰度值与BSA（+BSA）的等效处理进行比较。统计p值显示在每帧的左下角。所示数据代表了从重复的独立实验中收集的三重图像。
图2
图2
NOV处理增加了MEF-1和Hs578T细胞中FN和LRP1的共定位。用增加浓度的新生霉素（NOV）处理细胞16 小时。细胞被固定并与小鼠抗FN（绿色）和兔抗LRP1（红色）一级抗体孵育，然后分别与驴抗小鼠Alexa Fluor-488和驴抗兔Alexa Fuor-546孵育。细胞核染色（1 μg/ml）Hoechst-33342（蓝色）。使用蔡司LSM 780 Meta激光扫描共焦显微镜上的63x物镜拍摄图像，并使用Zens-Blue软件（德国蔡司）进行分析。散点图是使用ImageJ中的强度相关分析插件生成的。数据代表从具有类似结果的一式三份独立实验中获得的图像。比例尺代表20μm。
图3
图3
NOV处理后，MEF-1细胞中LRP1和Hsp90共定位。用增加浓度的新生霉素（NOV）处理MEF-1细胞16 小时。细胞固定并与山羊抗人Hsp90α/β（绿色）和兔抗人LRP1（红色）孵育，然后与驴抗山羊Alexa Fluor-660和驴抗兔Alexa Fuor-546孵育。细胞核染色（1 μg/ml）Hoechst-33342（蓝色）。使用蔡司LSM 780 Meta激光扫描共焦显微镜上的63x物镜拍摄图像，并使用Zens-Blue软件（德国蔡司）进行分析。散点图是使用ImageJ中的强度相关分析插件生成的。数据代表了从具有类似结果的三次独立实验中获得的图像。比例尺表示20μm。
图4
图4
NOV处理增加了MEF-1和Hs578T细胞中LRP1和LAMP1的共定位。用增加浓度的新生霉素（NOV）处理细胞16 小时。细胞固定并与兔抗LRP1（红色）一级抗体孵育，然后与驴抗兔Alexa-fluro-488和小鼠抗LAMP1 Alexa-Fluro630（绿色）孵育。细胞核染色（1 μg/ml）Hoechst-33342（蓝色）。使用蔡司LSM 780 Meta激光扫描共焦显微镜上的63x物镜拍摄图像，并使用Zens-Blue软件（德国蔡司）进行分析。散点图是使用ImageJ中的强度相关分析插件生成的。数据代表了从具有类似结果的三次独立实验中获得的图像。比例尺代表20μm。
图5
图5
Hsp90、LRP1和FN在MEF-1和Hs578T细胞中以共同的复合物存在。(A类)MEF-1和(B类)用NOV处理Hs578T裂解物，并用兔抗LRP1抗体检测LRP1。肌动蛋白或GAPDH分别作为负荷对照。(C类)MEF-1和(D类)Hs578T细胞未经处理（U）或用50 μM NOV（N）16 小时。细胞外蛋白与细胞不相容交联剂DTSSP交联，含LRP1的复合物通过免疫沉淀（IP）与LRP1或同型对照IgG抗体分离。洗脱组分在10%SDS凝胶上分离，并分别使用兔抗FN、兔抗LRP1和鼠抗Hsp90一级抗体探测FN、LRP1及Hsp90。FN和Hsp90表达水平的密度测定是相对于每个免疫沉淀中LRP1的数量进行的，并以条形图表示。使用Bonferroni后验的单向方差分析进行统计分析。所示数据代表了具有类似结果的重复实验。
图6
图6
LRP1阻断抗体导致FN基质丢失，可被可溶性Hsp90β挽救。用新生霉素（NOV；500）处理Hs578T细胞 μM）用于1 37小时 °C，然后用阻断LRP1抗体（mLRPab；2 μg/ml）10 添加外源性Hsp90β（100 ng/ml）过夜。使用兔抗人FN和驴抗兔DyLight®488荧光二级抗体对固定细胞进行染色。细胞核用Hoechst 33342染色（1 μg/ml）。使用蔡司LSM 510 Meta激光扫描共聚焦显微镜拍摄图像，并使用Zen软件蓝色版（德国蔡司）进行分析。比例尺相当于20μm。每帧顶部的值（白色）代表每个核的平均灰度值 ± 标准偏差（n = 3） 每次治疗。使用单向方差分析和Tukey Post Test比较所有值，比较平均灰度值。将NOV和LRP1阻断抗体（mLRPab）处理的平均灰度值与未处理的细胞进行比较。LRP1阻断抗体和外源性Hsp90β处理（mLRPab）的平均灰度值 + 将Hsp90β）细胞与不含外源性Hsp90α（mLRPab）的等效处理进行比较。所有三种处理（NOV）组合的平均灰度值 + mLRPab公司 + Hsp90β）与未经处理的细胞进行比较。统计p值显示在每个帧的左下角。所示数据代表了从重复的独立实验中收集的三重图像。
图7
图7
FN的丢失是LRP1表达细胞中C末端Hsp90抑制所特有的。(A类)用增加浓度的新生霉素（NOV）处理粘附的MEF-1和PEA-13(B类)格尔德霉素（GA）或(C类)SM253用于16 37小时 摄氏度。细胞被裂解，总蛋白（50 μg）用兔抗FN一级抗体检测FN水平。组蛋白H3和肌动蛋白被用作负荷控制。使用ImageJ测定旁边的密度。在GraphPad Prism 4（*p）中使用双向方差分析确定统计显著性 < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001). 误差条指示 ± 标准偏差（n = 3).
图8
图8
抑制Hsp90对MEF-1和PEA-13细胞中FN降解的影响。处理MEF-1和PEA-13细胞(A类)带（+）或不带（−）MG132（5 μM）和(B类)有（+）或（−）无氯喹（CLQ）（100 μM）有无200 16年11月μM 在溶出和探测FN水平之前的小时。统计显著性由GraphPad中的未配对双尾Student t检验确定，并在旁边的条形图中显示。(C类)MEF-1细胞用100 在新生霉素（NOV 200）存在或不存在的情况下，μg/ml环己酰亚胺（CHX） μM）和在指定时间点制备的裂解物。用兔抗FN抗体在western blot上检测等量的总蛋白以检测FN。组蛋白H3用作负荷对照。相关的密度测定是使用ImageJ软件确定的，并与之一起提供。数据代表了三次独立实验。
图9
图9
MEF-1而非PEA-13细胞对NOV反应时不溶性细胞外FN的丢失。(A类)用增加剂量的新生霉素（NOV）处理MEF-1、Hs578T和PEA-13细胞16 37小时 摄氏度。收集等量的细胞，并使用DOC分析分离可溶性和不溶性FN组分（Brenner等用兔抗人FN抗体免疫印迹法检测FN水平。在ImageJ中确定的带强度的密度测定值显示在条形图中，该条形图表示旁边的重复实验。在GraphPad Prism 4（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001). (B类)MEF-1和PEA-13细胞经16 新生霉素作用小时（NOV 200 μM）或未经处理。通过链霉亲和素亲和层析和等量细胞的生物素化组分纯化表面生物素化蛋白，并通过western分析检测裂解产物中是否存在FN和LRP1。所示数据代表了三次独立实验。
图10
图10
NOV在表达LRP1的Hs578T和MEF-1细胞中诱导纤连蛋白基质的内化，但在缺乏LRP的PEA13细胞中不诱导。让细胞在15孔的玻璃底ibidi微皿中粘附过夜，并用增加浓度的NOV处理细胞(A类)Hs578T细胞（0-500 μM）和(B类)MEF-1和PEA-13细胞（0–1000 μM）用于16 37小时 摄氏度。细胞用乙醇固定，然后用小鼠抗FN一级抗体（ab194395）孵育，然后用驴抗鼠Alexa Fluor-488孵育。使用蔡司LSM 780 Meta激光扫描共聚焦显微镜和63x油物镜拍摄图像，并使用Zen Blue软件进行分析。白色箭头表示细胞外FN基质或FN纤维，红色箭头表示细胞内FN。比例尺代表20μm。所示数据代表了所有情况下从三次重复实验中获得的结果。
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