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.2018年10月15日：390:46-59。
doi:10.1016/j.neuroscience.2018.07.029。 Epub 2018年7月27日。

人类星形胶质细胞中IGF1R的缺失改变复合物I的活性和对神经元的支持

劳拉·E·拉特克利夫 1, 伊琳娜·瓦兹奎斯·维拉塞诺 1, 卢克·杰宁斯 1, 保罗·R·希思 1, 希瑟·莫蒂波伊斯 1, 奥雷莉·施瓦岑特鲁伯 1, 伊万杰利亚·卡里卡 1, 朱莉·辛普森 1, 保罗·因斯 1, 克莱尔·加伍德 2, 斯蒂芬·沃顿 1
附属公司

人类星形胶质细胞中IGF1R的缺失改变复合物I的活性和对神经元的支持

劳拉·E·拉特克利夫等。 神经科学. .

摘要

胰岛素/胰岛素样生长因子1（IGF1）信号通路与老年痴呆症的长寿和进展有关。此前，我们发现随着阿尔茨海默病神经病理学的进展，人脑星形胶质细胞中的胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）和下游信号转录物减少，并使用IGF1R特异性单克隆抗体MAB391建立了人类星形胶质细胞IGF1信号损伤模型。在这里，我们建立了一个新的人类星形胶质细胞-神经元共培养系统，以确定星形胶质细胞IGF1R的丢失是否影响其对神经元的支持。使用人类原代星形胶质细胞和分化的Lund人类中脑细胞（LUHMES）进行星形胶质细胞-神经元共培养。神经突起生长分析用于测量星形胶质细胞对神经元的支持，显示星形胶质细胞为神经突起的生长提供了接触介导的支持。在对照条件下，IGF1R的缺失并不影响神经突起的生长，但当受到过氧化氢的刺激时，IGF1R-受损的星形胶质细胞对LUHMES的保护能力较差。为了确定IGF1R的丢失如何影响MAB391处理的星形胶质细胞的神经支持，从GFP-LUHMES中提取FACS，并使用微阵列研究其转录组。参与星形胶质细胞能量代谢的转录物发生了变化，尤其是NDUFA2和NDUFB6，它们与复合物I组装有关。MAB391处理的星形胶质细胞中复合物I活性的丧失证实了这些发现。总之，在应激条件下，星形胶质细胞中IGF1信号的减少会损害其对神经元的支持，这与星形胶质细胞线粒体呼吸链的缺陷有关。

关键词：IGF1；星形胶质细胞；代谢；线粒体；氧化应激。

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数字

图1
图1
共同培养的人类ScienceCell®星形胶质细胞和LUHMES。示意图描述了建立共同文化体系的时间线。第0天，通过向培养基中添加四环素来分化LUHMES。两天后，将分化的LUHMES接种到对照星形胶质细胞上。然后将LUHMES和星形胶质细胞共培养72小时 固定前h，显示共培养细胞的相位对比图。（A-C）。72天后共同培养的LUHMES和星形胶质细胞的免疫细胞化学 共同培养的h。LUHMES用β-Ⅲ-管蛋白（绿色）免疫标记，细胞核用Hoechst（蓝色）标记，星形胶质细胞用（A）波形蛋白、（B）ALDH1L1和（C）GFAP标记（均为红色）。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
图2
图2
中性粒细胞的生长通过与星形胶质细胞的直接接触而增强。将LUHMES与星形胶质细胞培养在星形胶质细胞条件培养基（ACM）或神经-星形胶质细胞条件性培养基（NACM）中，以确定增强的轴突生长是接触介导的还是由星形胶质细胞释放的可溶性因子引起的。（A） GFP LUHMES在单培养、星形胶质细胞调节培养基（ACM）或共培养条件下生长24小时的代表性图像 h.（B）单培养、神经-星形胶质细胞条件培养基（NACM）或共培养24小时的GFP LUHMES的代表性图像 h.（C）GFP LUHMES也与成纤维细胞共同培养，以证实增强的神经突起生长是一种星形胶质细胞特异性效应。柱状图显示了神经突起长度的量化，数据为平均值Ş+Ş扫描电镜(n个 = 3，3个重复/实验，单因素方差分析和事后分析，***第页 < 0.001,**** = 第页 < 0.0001).
图3
图3
星形细胞IGF1R的丢失不会损害对神经突起生长的支持。（A） 原代星形胶质细胞细胞裂解物的蛋白印迹。星形胶质细胞治疗24小时 用MAB391诱导IGF1R丢失，并在培养基交换后再培养72小时 h.显示了用IGF1Rβ和pAkt抗体探测的代表性western blot（s473）。条形图显示了IGF1Rβ相对于α-微管蛋白的定量，以及pAkt相对于总Akt的定量（s473）。数据均为平均值 + 扫描电镜(n个 = 3、3次重复/实验，未配对学生t吨-测试* = 第页 < 0.05和** = 第页 < 0.01). （B） GFP LUHMES单独培养或与对照、IgG或MAB391处理的星形胶质细胞共同培养72个 评估h和神经突起的生长情况（比例尺代表50 μm）。图中显示了GFP LUHMES的代表性图像，条形图显示了轴突长度的量化（以像素为单位测量）。数据均为平均值 + 扫描电镜(n个 = 3，3个重复/实验，具有事后分析的单向方差分析，**** = 第页 < 0.0001).
图4
图4
IGF1R受损的星形胶质细胞神经保护作用较弱。GFP-LUHMES单独或与对照、IgG或MAB391处理的星形胶质细胞一起培养72 h.72后 h共培养物用50 微米高2O（运行）2对于2 h.显示了GFP-LUHMES的代表性图像，比例尺表示50 微米。条形图显示了这些图像中神经突长度的量化（以像素为单位）。数据均为平均值 + 扫描电镜(n个 = 3、3次重复/实验，未配对学生t吨-测试，*** = 第页 < 0.001和**** = 第页 < 0.0001).
图5
图5
GFP LUHMES星形胶质细胞的FACS分类。（A） 用或不用MAB391处理星形胶质细胞24小时 h、 洗涤并与GFP LUHMES共培养72 h.星形胶质细胞和LUHMES经FACS分类，分别收集在Trizol中，用于RNA提取。然后对从星形胶质细胞中分离的RNA进行微阵列基因表达分析。（B） 对星形胶质细胞、GFP LUHMES和共培养物进行FACS。根据SSC（侧面散射）剖面和荧光（蓝色530-30-A）对细胞进行门控。（C） DNA凝胶显示FACS共培养分类后星形胶质细胞富集；GFAP作为星形细胞标记物，NeuN作为神经元标记物，β-actin作为负荷对照。DNA凝胶载量如下：星形胶质细胞单培养、未分化LUHMES单培养、FACS分类星形胶质细胞和FACS分类分化LUHMES。
图6
图6
IGF1R受损的星形胶质细胞具有复合物I的缺陷。（A）qRT-PCR显示NDUFA2型和NDUFB6型MAB391治疗后，表中显示了NDUFA2型和NDUFB6型在微阵列分析和qRT-PCR中。（B） 复合物I分析也表明，与共培养的经IgG处理和未经处理的星形胶质细胞相比，经MAB391处理的星形细胞降低NADH的能力较弱。数据均为平均值 + 扫描电镜(n个Ş=Ş4，3个重复/实验，单因素方差分析和事后分析，* = 第页 < 0.05和** = 第页 < 0.01). （C） 还对MAB391处理的单培养人星形胶质细胞进行了复合物1分析，以确认共同培养的减少是由于星形胶质细胞中复合物1活性的变化所致。数据均为平均值Ş+ŞSEM和标准化以控制（3次技术重复，单因素方差分析和事后分析，** = 第页 < 0.01).
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