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.2018年11月；28(6):860-874.
doi:10.1111/bpa.12628。 Epub 2018年10月9日。

HIF-1α的敲除通过缺乏归巢和发芽的bmEPC损害脑缺血后血管重建

杨柳 1, 他跑了 1 2 三, 肖亚萍 1 2 三, 王宏进 1 2 三, 易晨 1 2 三, 陈威海 4, 徐晓宇（Xiaoyu Xu） 1 2 三
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HIF-1α的敲除通过缺乏归巢和发芽的bmEPCs损害脑缺血后的血管重建

杨柳等。 大脑病理学. 2018年11月.

摘要

虽然缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在脑卒中后新生血管形成中的关键作用已经得到了很好的表征，但HIF-1β对内皮祖细胞（EPC）依赖性新生血管形成的调控细节还不完全清楚。利用慢病毒shRNA敲除HIF-1α，我们发现HIF-1在缺血性Sprague-Dawley（SD）大鼠脑急性期骨髓源性EPC（bmEPC）归巢和发芽中起着核心作用。首先，HIF-1α的敲低降低了内源性和外源性bmEPCs向缺血性脑的归巢。此外，敲除损伤了缺血脑中bmEPCs的掺入和萌发。体外，HIF-1α的敲除抑制了bmEPCs的球状芽生和管状形成。从机械角度来看，缺血脑中HIF-1α依赖性的bmEPCs募集与CXCL12/CXCR4轴和HMGB1有关，后者与星形胶质细胞有关。此外，HIF-1α的缺失导致缺血脑、骨髓基质干细胞和星形胶质细胞中VEGF-A、Flk-1、NRP1和Dll4的表达水平不足。这些发现表明HIF-1α通过CXCL12/CXCR4和HMGB1参与bmEPC归巢，并通过VEGF-A/flk1-NRP1/Dll4促进bmEPC萌芽。

关键词：HIF-1α；细胞归巢；脑缺血；内皮祖细胞；新生血管；维管束萌芽。

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利益冲突声明

所有作者都声明不存在利益冲突。

数字

图1
图1
击倒高频高频急性缺血后大脑中的-1α损害了神经缺陷的恢复。A类。显示了本研究的方案。B类。表示在的第14天MCAO公司，梗死体积高频高频‐1αsh核糖核酸治疗组大鼠比对照组大得多核糖核酸大鼠（n=7）。C显示有代表性的脑梗死图像。第14天，梗死组织与以下组织相关：1个初级运动皮层、2个躯体感觉皮层、3个纹状体、4个岛状梨状皮层和5个胼胝体。根据这些受损区域，新生血管主要集中在投资回报率s、 分别是6区（皮层）和7区(SVZ公司). D和E显示mNSS公司分数和rCBF公司在中MCAO公司给药的大鼠高频高频‐1αsh核糖核酸（n=7）。的初始值rCBF公司在大脑的外周区域（脑前角尾侧2毫米，中线侧3毫米）MCAO公司以手术为基线。数据表示为平均值±S.D。
图2
图2
击倒高频高频‐1α导致缺血核心周围区域新生血管受损。闭塞14天后，取脑观察梗死体积和血管密度。面板A显示了脑血管结构的受损重建高频高频‐1α‐sh核糖核酸1处理MCAO公司胡扯。B类使用30微米的脑切片通过标记来观察血管密度光盘31.单身光盘在AOI公司放大20倍。结果表明，在高频高频‐1α‐sh核糖核酸1处理MCAO公司胡扯。C和D是相关区域血管密度的统计分析，表明MCAO HIF公司‐1αsh核糖核酸大脑（n=29–32个区域，每组5到6个大脑）。棒材，200μm。数据表示为平均值±S.D。
图3
图3
击倒高频高频‐1α损害内源性bm的归巢和结合工程总承包在缺血的大脑中。在MCAO公司手术后，分离缺血脑。制备厚度为20μm和40μm的切片用于免疫染色。感兴趣的区域是梗死周围的区域（脑角尾侧2毫米，中线侧3毫米）。自导bm工程总承包s标记为flk1/光盘34（A）或光盘在放大20倍的条件下，对每个区域的133/flk1（B）进行计数。棒材，50μm。A类.归巢的合并工程总承包共聚焦z‐堆栈的三维重建显示了s。C和D分别是图片A和B的列（每组5-6个大脑中的n=21-25个区域）。E类三重免疫染色的共焦图像光盘34/flk1/α‐座椅模块组件用于识别bm工程总承包s和缺血区周细胞。数据以平均值±标准差表示。
图4
图4
击倒高频高频‐1α损害移植骨髓的归巢、掺入和发芽工程总承包在缺血的大脑中。A类是实验方案。bm公司工程总承包从骨髓中分离s并扩增在体外持续14天。BrdU标记为bm工程总承包s用对照sh治疗核糖核酸或高频高频‐1αsh核糖核酸并注入MCAO公司给大鼠大脑注射对照sh核糖核酸或高频高频‐1αsh核糖核酸.B类.七天后MCAO公司手术后，取脑进行BrdU免疫染色。闭塞10天后，分离大脑，观察外源性bm的掺入和Dll4表达水平工程总承包s.白色箭头表示合并或Dll4‐正bm工程总承包第条。C–E类是（B）的统计分析（每组5‐6个大脑的n=22–29个区域）。棒材，50μm。数据表示为平均值±S.D。
图5
图5
击倒高频高频‐1α减少了缺血脑中尖端细胞的数量。在MCAO公司手术后，大脑被切除。制备厚度为30μm的切片并固定。感兴趣的区域是梗死周围的区域（脑角尾侧2 mm，中线侧3 mm）。尖端细胞标记有vWF公司/Dll4（A）、flk1/Dll4自然资源保护计划1/Dll4（E）。以20倍的放大倍数对每个区域的双阳性细胞进行计数。C、 D和F分别是图片A、B和E的统计分析（n=24–28个区域，每组5到6个大脑）。棒材，60μm。数据以平均值±标准差表示。
图6
图6
击倒高频高频‐1α破坏了招募bm的微环境工程总承包第条。A类.第7天MCAO公司取脑组织，制备20μm脑组织切片并固定进行免疫染色。的平均灰度值AOI公司s用于量化HMGB公司1表达式和GFAP公司表达。B类和C类是面板（A）的统计分析（n=3）。D、 E类术后第7天分离大脑进行免疫印迹MCAO公司手术。F类.初级骨髓来源工程总承包s和星形胶质细胞在梯度氧气条件下培养8h。然后，收集细胞进行蛋白质表达分析CXCR公司4,HMGB公司1，和CXCL公司12通过western blotting。数据来自至少3个独立实验。（n=23–28个区域，每组5到6个大脑）。棒材，60μm。数据表示为平均值±S.D。
图7
图7
击倒高频高频‐1α导致缺陷在体外骨髓的血管生成工程总承包第条。A类.bm型工程总承包s在2%O的培养基上培养2观察管子的形成。骨髓的细胞体工程总承包s用控制sh处理核糖核酸拉伸（用白色箭头表示）并相互连接形成管子。然而，在高频高频‐1αsh核糖核酸治疗组，试管形成受到抑制。B类.球形bm工程总承包s在基质胶中在2%O下培养2观察bm工程总承包正在发芽。每个bm中都有球状芽工程总承包对各组的球体进行计数。C类和D类分别是A和B的统计分析（n=5-7）。（E） 是的蛋白质印迹血管内皮生长因子‐对照组脑缺血后的A和flk1核糖核酸或高频高频‐1αsh核糖核酸.（F）主bm工程总承包梯度氧培养s和星形胶质细胞；初级bm工程总承包s和星形胶质细胞高频高频‐1αsh核糖核酸或控制sh核糖核酸在2%O下培养2.白条，30μm。黑条，200μm。数据表示为平均值±S.D。
图8
图8
模型高频高频‐1 bm的调节工程总承包依赖性新生血管。当发生脑缺血时，高频高频‐1由于其低氧传感器亚单位的稳定而稳定高频高频‐1α. 增加高频高频‐1有助于骨髓衍生工程总承包秒（bm工程总承包s） 通过激活CXCL公司12/CXCR公司4轴和HMGB公司1在反应性星形胶质细胞和bm之间工程总承包s.此外，高频高频‐1通过促进bm规范促进新生血管生成工程总承包s转化为尖端细胞，其过程与血管内皮生长因子‐A/flk1‐自然资源保护计划1/Dll4轴。该工作模型为脑缺血的病理学和潜在的治疗靶点提供了对新生血管形成的细胞和分子理解。
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