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.2018年10月：73:21-33。
doi:10.1016/j.bbi.2018年7月17日。 Epub 2018年7月21日。

PICALM将LRP1和ABCB1/P-gp通过血脑屏障的协同淀粉样β清除联系起来

斯特芬·E·斯托克 1, 安妮卡·M·S·哈特兹 2, 杰西卡·伯纳德 1, 安德烈亚·沃尔夫 三, 安德烈·卡奇迈耶 1, 安妮·马林格 4, 萨沙·威根 5, 延斯·彭克 6, 克劳斯·彼得齐克 7
附属公司

PICALM将LRP1和ABCB1/P-gp通过血脑屏障的协同淀粉样β清除联系起来

斯特芬·E·斯托克等。 大脑行为免疫. 2018年10月.

摘要

脑内神经毒性淀粉样β（Aβ）的积聚是阿尔茨海默病（AD）的特征性标志。血脑屏障（BBB）提供了大的表面积，并已被证明是去除大脑aβ的重要介质。ABC转运体P-糖蛋白（ABCB1/P-gp）和受体低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）均被认为在脑Aβ流出中发挥关键作用。在这里，通过免疫沉淀实验、联合免疫染色以及ABCB1/P-gp和LRP1的双重抑制，我们表明这两种蛋白在功能上是相互联系的，通过内皮细胞介导aβ的协同跨细胞作用。晚发型AD危险因素磷脂酰肌醇结合氯氰菊酯组装蛋白（PICALM）与ABCB1/P-gp和LRP1相关，代表功能联系并引导这两种蛋白通过脑内皮。总之，我们的结果对Aβ在BBB中的转运提供了更多的机制性见解，并表明不同清除蛋白的功能相互作用是从大脑中快速清除Aβ所必需的。

关键词：ABC转运体B1/P-糖蛋白（ABCB1/P-gp）；阿尔茨海默病；淀粉样β（Aβ）；血脑屏障；清除；内皮细胞；内皮；低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）；磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白（PICALM）；粒细胞增多症。

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数字

图1。
图1。
ABCB1/P-gp表达在Lrp1号机组击倒毛细血管。（A） ABCB1/P-gp的代表性免疫印迹体外与对照组分离的毛细血管(Lrp1型比利时飞行/飞行)和脑内皮特异性Lrp1号机组淘汰赛(Lrp1号机组比利时−/−)老鼠。抗β-肌动蛋白免疫印迹显示为负荷控制。（B） 量化n=5个独立实验中ABCB1/P-gp表达的相对丰度。每次分离时，每组使用≥3只小鼠（平均值±SEM）。对于统计分析，未配对t吨使用了测试**P（P）< 0.01.
图2。
图2。
ABCB1/P-gp抑制对[125一] Aβ1−42跨细胞移植Lrp1号机组敲除内皮细胞。[125一] -Aβ1−42通过LRP1淘汰赛运输(Lrp1号机组比利时−/−)和控制(Lrp1型比利时−飞行/飞行)在1μCi/ml的浓度下对小鼠脑毛细血管内皮细胞单层进行了研究[14C] -菊糖，用于被动扩散。通过测量以下各项的dpm，分析脑血方向（从白蛋白到管腔）的细胞吞噬功能[14C] -菊粉和TCA可沉淀物的cpm[125一] -放射性。运输速率标准化为对照运输速率Lrp1号机组比利时飞行/飞行脑内皮细胞中没有任何抑制剂。在0.1 nM的生理浓度下研究运输[125一] -Aβ1−42和5μM PSC833或10μM环孢素A（CSA）。数据表示n=18的平均值±SEM；从左到右，至少2个独立实验的n=21，n=27，n=17，n=11。在统计分析中，使用了重复测量方差分析和Bonferroni多重比较***P（P）< 0.001.
图3。
图3。
尽管LRP1 NPxYxxL敲除内皮细胞中ABCB1/P-gp表达增强，但ABCB1/P-gp抑制对[125一] Aβ1−42细胞转化。（A） 对照组离体毛细血管ABCB1/P-gp的免疫印迹分析(Lrp1型比利时飞行/飞行)，内皮特异性Lrp1号机组淘汰赛(Lrp1号机组比利时−/−)和LRP1 NPxYxxL敲入(Lrp1号机组比利时NPxYxxL/NPxYxxxL)老鼠。每组n≥3只小鼠的n=2个独立隔离的代表性结果。在相同的蛋白质印迹上分析裂解物，但为了更清晰的呈现而重新排列（B）[125一] -Aβ1−42在1μCi/ml的存在下，研究了穿过原代小鼠脑毛细血管内皮细胞单层的转运[14C] -菊糖，用于被动扩散。通过测量以下各项的dpm，分析脑血方向（从白蛋白到管腔）的细胞吞噬功能[14C] -菊粉和可沉淀TCA的cpm[125一] 放射性。运输率标准化为Lrp1型比利时飞行/飞行没有PSC833的脑内皮细胞。在0.1 nM的生理浓度下研究运输[125一] -Aβ1−42数据代表的平均值±SEMn个= 12; 从左到右，3个独立实验的n=20，n=19，n=14。在统计分析中，使用了重复测量方差分析和Bonferroni多重比较***P（P）< 0.001.
图4。
图4。
11E2抗LRP1抗体是一种有效的LRP1抑制剂，不会干扰ABCB1/P-gp功能。（A） 11E2抗LRP1抗体可减少0.1 nM的摄入[125一] Aβ1−42小鼠胚胎成纤维细胞（MEF wt），但（B）对0.1 nM的摄取没有影响[125一] Aβ1−42在里面Lrp1号机组-无能小鼠胚胎成纤维细胞（MEF LRP1−/−)（A）和（B）的结果表示一个实验中n≥9的平均值和SEM。（C） 11E2抗LRP1抗体对ABCB1/P-gp功能无影响。对于管腔NBD-CSA荧光，每个数据点代表单个制剂中7条毛细血管的平均值（30只CD-1小鼠的混合组织）；变化性由SEM条给出。单位是任意荧光单位（刻度0–255）。（D） 分离脑毛细血管中LRP1的免疫荧光染色。比例尺：5μm。在统计分析中，使用了重复测量方差分析和Bonferroni多重比较**P（P）<0.01***P（P）< 0.001.
图5。
图5。
ABCB1/P-gp抑制剂PSC833和CSA不影响LRP1功能将FITC-标记的α-巨球蛋白（FITC-α2m）摄取到表达LRP1的CHO K1细胞中。将细胞在50μg/ml FITC-α2m和15μg/ml非特异性IgG（A）、15μg/ml 11E2抗LRP1（B）、5μM PSC833（C）或10μM环孢菌素A（CSA）存在下孵育60分钟，洗涤、固定并进行荧光检测。阴性对照，不含FITC-α2m（D）。
图6。
图6。
同时抑制LRP1和ABCB1/P-gp对Aβ没有额外的影响1−42细胞转化。（A） Aβ1−42猪脑内皮细胞单层膜的转运[125一] -Aβ1−42在1μCi/ml的存在下研究了转运[14C] -菊糖，用于被动扩散。通过测量以下各项的dpm，分析脑血方向（从白蛋白到管腔）的细胞吞噬功能[14C] -菊粉和可沉淀TCA的cpm[125一] 放射性。将转运率归一化为未经处理的脑内皮细胞的转运率。在0.2 nM的生理浓度下研究运输[125一] -Aβ1−42对于ABCB1/P-gp抑制5μM PSC833和LRP1抑制20μg/mL 11E2抗LRP1。数据代表的平均值±SEMn个= 12; 两个独立实验从左到右依次为n=20，n=19，n=14。氯喹组代表一个实验中n=4的数据。（B+C）Aβ1−42在孤立的毛细血管中运输。对于luminal HiLyte™-Aβ1–42荧光，每个数据点表示来自单个制剂（来自30只CD-1小鼠的合并组织）的10个毛细管的平均值；可变性由SEM条给出。使用5μM PSC833（B）或10μM环孢素A（CSA）（C）抑制ABCB1/P-gp，使用15μg/mL 11E2抗LRP1抑制LRP1。单位是任意荧光单位（刻度0–255）。在统计分析中，使用了重复测量方差分析和Bonferroni多重比较**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图7。
图7。
LRP1、ABCB1/P-gp和PICALM的共免疫沉淀。（A和B）使用不同抗体在脑内皮细胞系bEnd.3中共免疫沉淀LRP1和ABCB1/P-gp。Rab11可以与ABCB1/P-gp和LRP1共同免疫沉淀。（C） PICALM和LRP1、ABCB1/P-gp、Rab11的共免疫沉淀，但不包括Rab7。两次实验的代表性结果（A+B），来自ABCB1/P-gp-IP（B）的数据是一次实验的结果。
图8。
图8。
从分离的毛细血管共免疫沉淀LRP1、ABCB1/P-gp、PICALM和Rab11。（A+B）三种蛋白LRP1、ABCB1/P-gp相互关联，存在于分离毛细血管的Rab11-阳性囊泡中。数据显示是从10只小鼠分离的毛细血管中进行的一项实验的结果。
图9。
图9。
ABCB1/P-gp与其他参与Aβ转运的蛋白质的共聚合。ABCB1/P-gp在bEnd.3细胞中与LRP1（A）、PICALM（B）和Rab11（C）共定位。比例尺：20μm。
图10。
图10。
Aβ刺激后与Rab11共同免疫沉淀LRP1、ABCB1/P-gp和PICALM。用1 nM Aβ刺激bEnd31–40持续5分钟。
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