跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2018年7月19日；13（7）：e0200913。
doi:10.1371/journal.pone.0200913。 2018年eCollection。

TLR9的酪氨酸870对受体成熟至关重要，而非磷酸化依赖性配体诱导的信号传导

Chhanda Biswas公司 1, 希拉·拉奥 1, 凯瑟琳·斯莱德 1, 大卫·海曼 1, 德文·德什 2, 阿德里亚娜·曼特加扎 2, 菲利普·佐利克 1, 迈克尔·马克斯 2 3, Yair Argon公司 2, 爱德华·M·贝伦斯 1
附属公司

TLR9的酪氨酸870对受体成熟至关重要，而非磷酸化依赖性配体诱导的信号传导

Chhanda Biswas公司等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）具有一个保守的结构，包括N末端外结构域、跨膜段和C末端细胞质Toll/IL-1受体（TIR）结构域。TIR结构域的正确组装对信号转导至关重要；然而，TIR域中的单个基序对TLR贩运和信号传递的贡献尚不清楚。我们靶向了一个高度保守的酪氨酸（Y870），该酪氨酸位于大多数TLR（包括TLR9）TIR结构域的框1区域，之前被描述为TLR4磷酸化的关键位点。我们从Tlr9-/-小鼠WT Tlr9、Y870F或Y870A突变体中重建骨髓源性树突状细胞（BMDC）。尽管与管腔伴侣GRP94和UNC93B1正常相互作用，Y870F仅对CpG产生部分反应，而Y870A在与内源性TLR9共表达时没有活性，并作为主要的阴性抑制剂发挥作用。这种功能丧失分别与80 kDa成熟型TLR9的减少或缺失有关。在Y870F表达细胞中，CpG依赖性信号传导与成熟形式的水平直接相关，这表明信号传导不需要酪氨酸磷酸化，而是由于加工或运输缺陷，Y870F-突变导致受体水平降低。显微镜下显示突变蛋白的靶向可能降解的自噬体样结构。总的来说，我们假设TIR结构域中保守的Y870不参与配体识别下游的磷酸化诱导信号传递，而是对正确的TIR组装和内质网出口至关重要，导致内溶体中TLR9的成熟特异性稳定和随后的促炎信号传递。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。TLR9酪氨酸870在TLR及其适配器中保守。
除TLR1、TLR6和TLR12外，小鼠TLR在TIR结构域的框1区域中有一个酪氨酸。N端和C端氨基酸位置分别标注在左侧和右侧。请注意，在Mal中划线的天冬氨酸残基被发现可能与晶体结构中的二聚表面有关[15]。
图2
图2。HA-tagged TLR9突变体在293 T细胞和BMDC中的表达。
（A） 用4μg HA标记的WT TLR9、Y870F或Y870A转染293T细胞。细胞未经处理（-）或用1μg/ml CpG处理18 h，用SDS-PAGE分离整个细胞裂解物，并用Western blot分析HA（TLR9）或Erk作为负荷对照。使用Odyssey开发印迹，并通过Licor软件进行分析。所显示的数据代表了至少4个独立的实验。（B）第9天-/-用表达HA标记的WT TLR9、Y870F或Y870A的逆转录病毒转导骨髓。采集BMDC，使其渗透并用CD11c和HA抗体染色。流式细胞术检测GFP+CD11c+细胞（左侧）HA表达（右侧）。直方图代表了至少5个独立的实验。（C）第9天-/-表达WT TLR9、Y870F或Y870A的BMDC未经刺激（Untrx）或用CpG（1μg/ml）刺激3小时。采集上清液，用ELISA法检测TNFα和IL-6。条形图代表至少4个独立实验，一式三份。*Bonferroni事后测试表明p值<0.05。
图3
图3。TLR9 Y870A的表达通过内源性TLR9以显性-阴性方式抑制配体诱导的细胞因子分泌。
（A） 293T细胞被HA和GFP标记的TLR9形式的WT（WT）或Y870A（A）变体共同转染，如图所示。使用HA抗体对HA标记的TLR9进行免疫沉淀，并通过免疫印迹法评估裂解物（输入物）和免疫沉淀物（IP:HA）中HA和GFP与GFP标记的TLR 9的相互作用。Erk的免疫印迹作为对照。结果代表了至少3个独立实验。（B） 以表达HA标记WT或Y870A TLR9或空载体的逆转录病毒转导WT（即TLR9足够）C57BL/6骨髓作为对照，然后分化为DC。用CpG刺激BMDC 3小时，然后采集上清液，用ELISA测定TNFα和IL-6。条形图代表至少3个独立实验，每个实验进行三次。*Bonferroni事后测试表明p值<0.05。（C） 用CpG刺激这些同样转导的BMDC不同时间，并对裂解产物进行Western blot分析，以确定是否存在HA标记的TLR9、phosho-Erk或total Erk。blot是3个实验的代表。（D） 磷酸化-肌醇激酶归一化为总肌醇激酶的代表性实验的量化。
图4
图4。TLR9 Tyr870的突变导致受体成熟受损。
（A、B）第9天-/-表达HA标记TLR9 WT、Y870F或Y870A的BMDC未经治疗（-）或用1 mg/ml CpG治疗18 h。（A） 通过Western blotting对细胞进行裂解并分析HA相对于Erk的表达，作为负荷对照。左边显示了3个实验中的代表性印迹。对，对160kDa和80kDa条带进行量化，并通过将处理的受体数量（80kDA）归一化为未处理的受体的数量（160kDA）来计算活性受体的数量。所示为3个实验的平均值。（B） 将WT或表达TLR9的突变型BMDC培养物中CpG诱导的TNFα和IL-6水平归一化为图4A中确定的处理（活性）受体数量。N.D.表示尚未确定，因为没有成熟的Y870A受体可以使细胞因子正常化。注意，如图2C所示，Y870A表达细胞中CpG诱导的细胞因子水平与未刺激样品基本相同。*Bonferroni试验后显示p值<0.05。（C） WT骨髓未感染（左）或用WT或Y870A TLR9转导，然后分化为BMDCs。如图3B所示，用CpG刺激细胞0、60或180分钟，通过HA免疫印迹（相对于总Erk作为负荷控制）评估这些细胞中过度表达的TLR9裂解为80kD形式，如（a）所示。所示为3个实验的代表。
图5
图5。TLR9 Y870A与ER驻留蛋白相互作用。
分别用4μg FLAG标记的UNC93B1和GFP标记的WT或Y870A TLR9或GFP载体对照转染293T细胞。收集裂解液并用抗GFP偶联琼脂糖珠进行免疫沉淀。通过Western blotting分析裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP:GFP）的等分样品中的GFP（检测~160kDa TLR9转基因或~30kDa GFP对照）、FLAG（检测UNC93B1转基因）、GRP94（检测相关内源性GRP94）或Erk作为对照。数据代表了3个独立实验。
图6
图6。Y870A TLR9从ER的缺陷出口导致无法生成活性受体。
（A）第9天-/-用WT或Y870A TLR9转导骨髓并分化为DC。在37°C下，在没有或存在Baf A（0.5μM）或Bref A（7 nM）的情况下培养BMDC对于4小时，或在30°C下放置18小时。然后通过HA免疫印迹法评估细胞裂解产物的TLR9处理。Erk显示为加载控件，未转换第9天-/-BMDC（TLR9 KO）显示为阴性对照。所示斑点是3个独立实验的代表。显示了代表全长TLR9前体（160 kDa）、Golgi改良全长TLR九（~180 kDa，或成熟加工TLR九）的条带位置。B.成熟80kDa TLR9产品的量化，在37度和30度条件下归一化为Erk，平均为3次实验所得结果。*p<0.001。
图7
图7。Y870A TLR9未保留在ER或高尔基中。
第9天-/-用强力霉素诱导的WT或Y870A HA标记的TLR9转导骨髓，并分化为DC。三天后，多西环素（0.5μg/ml）处理诱导蛋白表达，并在多西环碱处理后4小时固定和渗透BMDCs。脱氧土霉素后4小时固定的细胞被标记为HA和晚期内体/溶酶体标记物LAMP1（A）、ER标记物Calreticulin（B）或高尔基体标记物GM130（C）。在所有病例中，用DAPI标记细胞核。每个面板显示一个WT和Y870A图像，表示每个单独标签的BMDC，一个合并图像（merged）和一个共定位图像，其中两个标记的重叠区域在通过Costes方法阈值化[24]后由白色区域（“共定位像素”）表示。HA与每个细胞器标记的共定位既表示为皮尔逊相关系数，也表示为与标记重叠的手动阈值化HA标记结构的百分比。*，p<0.01；**，p＜0.005；***，p＜0.0001。
图8
图8。Y870A TLR被自噬消耗。
第9天-/-用强力霉素诱导的WT或Y870A HA标记的TLR9转导骨髓，并分化为DC。三天后，用强力霉素（0.5μg/ml）诱导蛋白表达，并在强力霉素治疗后4小时和24小时固定和渗透BMDCs。强力霉素后4小时固定细胞被标记为HA和自噬体标记物SQSTM1/p62（A）或LC3B（B），然后被种特异性Alexa568-和Alexa488-结合二级抗体标记。脱氧土霉素固定细胞24小时后标记HA和LAMP1（C）。在所有病例中，用DAPI标记细胞核。每个面板显示一个WT和Y870A图像，表示每个单独标签的BMDC，一个合并图像（merged）和一个共定位图像，其中通过Costes方法阈值化后两个标记重叠的区域由白色区域（“共定位像素”）表示。HA与每个细胞器标记的共定位既表示为皮尔逊相关系数，也表示为与标记重叠的手动阈值化HA标记结构的百分比。*，p<0.01；**，p<0.005；***，p<0.0001。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

工具书类

    1. 梅德韦杰夫AE。Toll样受体多态性，炎症和传染病，过敏和癌症。干扰素细胞因子研究杂志2013；33(9):467–84. 电子出版2013/05/17。10.1089/jir.2012.0140；公共医疗中心PMCID:PMC3760066。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 武田K、Kaisho T、Akira S.Toll样受体。免疫学年度回顾。2003;21:335–76. 电子出版2003/01/14。10.1146/annurev.immunol.21.120601.141126[pii]。-内政部-公共医学
    1. Brinkmann MM、Spooner E、Hoebe K、Beutler B、Ploegh HL、Kim YM。内质网膜蛋白UNC93B与TLR3、7和9之间的相互作用对TLR信号传导至关重要。细胞生物学杂志。2007;177(2):265–75. 电子出版2007/04/25。doi:jcb.200612056[pii]10.1083/jcb.2000612056；PubMed Central PMCID:PMC2064135。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kim YM、Brinkmann MM、Paquet ME、Ploegh HL。UNC93B1向内溶酶体传递核苷酸感应类toll受体。自然。2008;452（7184）：234–8。电子出版2008/02/29。10.1038/nature06726[pii]。-内政部-公共医学
    1. Ewald SE、Engel A、Lee J、Wang M、Bogyo M、Barton GM。Toll样受体对核酸的识别与组织蛋白酶和天冬酰胺内肽酶的逐步加工耦合。《实验医学杂志》2011；208（4）：643–51。电子出版2011/03/16。10.1084/jem.20100682[pii]；公共医疗中心PMCID:PMC3135342。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型