跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2018年9月4日；28（3）：400-414.e8。
doi:10.1016/j.cmet.2018.06.011。 Epub 2018年7月12日。

线粒体融合蛋白2调节钙蛋白酶抑制剂的轴索转运以防止骨骼肌神经肌肉突触消除

王鲁文（Luwen Wang） 1, 居高（Ju Gao） 1, 刘静怡 1, 桑德拉·西德拉克 1, 桑迪·托雷斯 1, 藤冈久志 2, 米卡伊拉·亨特利 1, 姜银飞 1, 海燕记 1, 亭香艳 1, 迈卡·哈兰德 1, Pichet Termsarasab公司 1, 索菲亚·曾 1, 镇江 1, 梁晶晶 三, 乔治·派瑞 4, 查尔斯·霍普佩尔 5, Cheng Zhang（张成） 6, 胡丽 6, 王兴龙 7
附属机构

丝裂霉素2调节Calpastatin的轴突转运防止骨骼肌神经肌肉突触消除

王鲁文（Luwen Wang）等。 单元格元. .

摘要

骨骼肌因疾病和衰老而萎缩。在这里，我们报道了丝裂原融合蛋白2（Mfn2）作为神经肌肉突触丢失的主要抑制因子来保护骨骼肌。Mfn2在转基因SOD1的脊髓中减少G93A公司和老龄小鼠。通过保护神经肌肉突触，增加神经元Mfn2可防止两种SOD1中的骨骼肌萎缩G93A公司而神经元Mfn2的缺失会导致神经肌肉突触功能障碍和骨骼肌萎缩。Mfn2也可以缓解坐骨神经横断后的神经肌肉突触丢失。Mfn2主要与钙蛋白酶抑制剂共存于线粒体相关膜（MAM）中，以调节其轴突运输。钙蛋白酶抑制剂的基因失活取消了Mfn2介导的神经肌肉突触保护。我们的结果表明，Mfn2可能是细胞质蛋白转运的一种新的、迄今尚未被认识的机制的潜在关键成分，在保护神经肌肉突触方面发挥着普遍作用，并成为骨骼肌萎缩的共同治疗靶点。

关键词：Mfn2；肌萎缩侧索硬化；轴突运输；钙蛋白酶抑制剂；线粒体；线粒体相关膜；神经损伤；神经肌肉突触；肌肉减少；骨骼肌萎缩。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。运动神经元中Mfn2缺乏导致明显的神经肌肉突触丧失和骨骼肌萎缩
（A） Mfn2中AAV1-Cre腰椎脊髓注射示意图飞行/飞行老鼠。ITR，反向末端重复；eSYN，由巨细胞病毒增强子和人突触蛋白I启动子组成的杂交启动子；增强型绿色荧光蛋白EGFP；T2A；thoseasigna病毒2A肽序列；Cre，重组酶。（B–H）腰脊髓、胸脊髓和大脑中Mfn2的代表性蛋白质印迹检测（B，每组n=3或4只小鼠），尾部悬吊试验（C），坐骨神经的超分子刺激引起的CMAP的图像和定量（D，每组n=9、6和6只小鼠），NMJ神经支配的图像和定量（运动终板用α-银杏毒素染色的E，绿色，AchR；神经肌肉突触用红色，SV2，每组n=5，6和3只小鼠），后肢骨骼肌的图像和量化（每组F，n=7，6和三只小鼠），L3–5背侧和腹侧神经根Epon包埋切片的甲苯胺蓝染色（G，定量如图S1E所示）和4–6个月大的Mfn2腰椎脊髓运动神经元（H）的定量飞行/飞行注射后2周或瘫痪期。载体：AAV1-GFP（注射后3-4周）；乘员：AAV1乘员。比目鱼肌（SOL）、趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）。所有印迹均加载等量的20μg蛋白质。数据为平均值±标准误差，代表三次试验。学生t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后是Tukey多重比较检验**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。
图2
图2。G93A小鼠运动神经元Mfn2上调显著延迟症状发作，并消除骨骼肌萎缩和神经肌肉突触丢失
（A） 终点G93A和dTg小鼠以及年龄匹配的160天龄NTG和TMFN小鼠（每组4只小鼠）脊髓中Mfn2水平的代表性western blot和量化。（B） G93A（雌性=14，雄性=6）和dTg小鼠（雌性=6，雄性=7）的发病年龄由后肢无力决定。（C） 终点骨骼肌的代表性图像和GAST肌肉重量的量化（120日龄组中每组6只、8只、5只和6只小鼠；160日龄组或终点组中每组13只、11只、16只和13只小鼠）。（D） 坐骨神经超最大刺激诱发的CMAP的代表性图像（终点）和量化（120日龄每组10、8、12和8只小鼠；160日龄或终点每组8、5、9和6只小鼠）。（E） NMJ神经支配和塌陷的代表性图像（终点）和量化（120日龄时每组5、5、3和3只小鼠；160日龄或终点时每组6、5、三和5只小鼠）。（F） 终点G93A和dTg小鼠以及年龄匹配的NTG和TMFN小鼠GAST肌肉中Agrin或Wnt3a的代表性免疫印迹（定量如图S2M所示）。（G） 在60日龄时注射AAV1-mitoDsRed的端点G93A和dTg小鼠以及年龄匹配的NTG和TMFN小鼠的GAST肌肉中线粒体长度和神经肌肉突触共定位的代表性图像和量化（每组3只小鼠中的n=11-14个神经突起或NMJ）。所有印迹均加载等量的20μg蛋白质。数据为平均值±标准误差，代表三次试验。一元方差分析（ANOVA），然后进行Tukey多重比较测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。
图3
图3。运动神经元Mfn2上调对老年小鼠神经肌肉突触的保护作用
（A） 6、12、26和36个月龄野生型小鼠脊髓、大脑和GAST肌肉中Mfn2、DLP1、OPA1、Mfn1和VDAC1水平的代表性免疫印迹和定量。相对水平均由GAPDH调整。n=每组3个。（B） 根据EM显微照片量化脊髓运动神经元、坐骨神经、海马神经元、皮质神经元和GAST肌肉中的线粒体长度。每组n>10。（C） 年轻（6月龄）和老年（22月龄）NTG和TMFN小鼠脊髓中Mfn2水平的代表性免疫印迹和定量（每组n=8、4、6和4）。加载等量的20μg蛋白质。（D） 年轻（6月龄）和老年（22月龄）NTG和TMFN小鼠脊髓运动神经元的典型EM和线粒体长度定量。n>10个神经元/组。（E） 年轻（6月龄）和老年（22月龄）NTG和TMFN小鼠（每组8、8、7和8只）坐骨神经超最大刺激诱发的CMAP的代表性图像和量化。（F） 年轻（6月龄）和老年（22月龄）NTG和TMFN小鼠（每组3、4、5和8只）GAST肌肉NMJ神经支配的代表性图像和量化。（G） 年轻（6月龄）和老年（22月龄）NTG和TMFN小鼠（每组12、16、9和16只）骨骼肌的代表性图像和GAST肌肉重量的量化。数据为平均值±s.e.m.，代表一式三份的实验。一元方差分析（ANOVA），然后进行Tukey多重比较测试*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。
图4
图4。运动神经元Mfn2上调保护神经肌肉突触和轴突免受坐骨神经横断
（A） 右侧坐骨神经切断（横断）和左侧坐骨神经假手术（假手术）的小鼠示意图。（B） 坐骨神经横断后2天，4-6个月大的NTG和TMFN小鼠后肢横断或假手术后坐骨神经超最大刺激诱发的CMAP代表性图像。（C） 右侧坐骨神经切断2天后，4-6月龄NTG和TMFN小鼠横断或误操作GAST肌肉中NMJ神经支配的典型图像和量化。n=每组4只小鼠。（D） 右侧坐骨神经切断7天后，4-6月龄NTG和TMFN小鼠横断或非手术GAST肌肉中NMJ神经支配的量化。n=每组3只小鼠。（E） 手术后2天，4-6个月大的NTG和TMFN小鼠后肢横断或假手术后坐骨神经中βIII微管蛋白和NF-L（神经丝轻亚单位）的代表性免疫印迹和定量。n=每组3只小鼠。所有印迹均加载等量的20μg蛋白质。（F） 术后第2天，4–6个月龄NTG和TMFN小鼠后肢横断或半手术后Epon-embedded坐骨神经切片的代表性甲苯胺蓝染色和轴突数量、变性和大小的量化。n=每组5、6、7和6。数据为平均值±标准误差，代表三次试验。一元方差分析（ANOVA），然后进行Tukey多重比较测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。
图5
图5。Mfn2通过线粒体运输依赖性主动轴突转运调节运动轴突中钙蛋白酶抑素的水平
（A和B）终点G93A和dTg小鼠、年龄匹配的NTG和TMFN小鼠（A）或4-6个月大的Mfn2中钙蛋白酶抑制剂的代表性免疫印迹和定量飞行/飞行小鼠注射AAV1-GFP（载体）或AAV1-Cre（Cre）12天后（B）。n=每组3或4只小鼠。（C） 在注射AAV1-钙蛋白酶抑制剂后的不同天，在3-4个月龄NTG小鼠的腰椎脊髓和坐骨神经中检测T2A标记的人钙蛋白酶抑制剂的代表性western blot。（D） 注射AAV1编码控制shRNA（AAV1-shCon.）或AAV1-sh Miro-1后12天，对3-4个月龄NTG小鼠进行代表性免疫印迹和钙蛋白酶抑制剂定量。n=每组3或4只小鼠。（E–H）从4只3–4个月龄NTG小鼠的混合脊髓中分离的MAM中分离出的calpastatin（用15 nm金颗粒标记）和Mfn2（用10 nm金粒子标记）的代表性western blot检测（E–G）和免疫电镜分析（H），有或没有显示的洋地黄素（w/v）、triton X-100（0.5%v/v）或胰蛋白酶处理（F和G）。H： 全脊髓匀浆；pM：从脊髓中分离出的高纯度线粒体。通过EM确认pM和MAM的纯度（图S5A和S5B）。（I和J）与丝裂原-FKBP-GFP和DsRed-FRB-ER（I，白色箭头指向ER募集到线粒体）或丝裂原FKBP-myc共转染2天后，活培养（I和J左面板）或固定（J右面板）神经元中线粒体和ER（I）或GFP标记的钙蛋白酶抑制剂的典型共聚焦图像，雷帕霉素治疗前后，Flag-FRB-ER和GFP标记钙蛋白酶抑制剂（J，白色箭头指向新形成的钙蛋白酶抑制剂斑点，而红色箭头指向扩大的先前存在的钙蛋白酶蛋白酶抑制剂斑点）。（K） 用丝裂原-FKBP-myc转染或共转染2天后，神经元内钙蛋白酶抑制剂轴突转运的定量（以从神经元胞体开始的200μm长的神经元过程段中钙蛋白酶抑制剂的平均灰度值与神经元胞体中钙蛋白酶蛋白酶抑制剂的平均灰度值的相对比值为指标），标记有或不标记雷帕霉素治疗30分钟的Flag-FRB-ER和GFP。每组15–24个神经元。所有印迹均加载等量的20μg蛋白质。数据为平均值±标准误差，代表三次试验。学生t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后是Tukey多重比较检验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.0001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。
图6
图6。钙蛋白酶抑制剂是Mfn2介导的神经肌肉突触保护所必需的
（A） 注射AAV1-shCon小鼠脊髓中钙蛋白酶抑素的代表性免疫印迹和定量。或将钙蛋白酶抑制剂（AAV1-shCalpastatin）靶向4-6月龄TMFN小鼠的腰椎脊髓2周。n=每组3只小鼠。（B） 右侧坐骨神经切断后2天，4-6个月大TMFN小鼠的横切或假手术GAST肌肉中NMJ神经支配的定量。在横断前12天，将指示的AAV1注射到小鼠的腰椎脊髓中。n=每组3只小鼠。（C和D）G93A和dTg小鼠在60日龄时将指示的AAV1注射到腰椎脊髓中，其瘫痪发病年龄（C，n=5-8只/组）和NMJ神经支配定量（D，n=5，4，3，5只/组，90日龄或瘫痪小鼠）。（E） Rosa26-hCAST KI小鼠的生成示意图。Cre重组后，STOP盒被移除，导致人钙蛋白酶抑素（CAST）在CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子下表达。右图所示TCAST小鼠脊髓中人钙蛋白酶抑制剂和Mfn2的代表性蛋白质印迹检测（请注意，所有市售的calpastatin抗体与人calpastation的亲和力都远高于小鼠calpastatin.免疫印迹分析不能反映人calpasstatin过度表达的实际水平）。（F和G）右侧坐骨神经切断后2天，4-6月龄TCAST小鼠坐骨神经（G）中NMJ神经支配（F）和代表性免疫印迹的定量，以及坐骨神经中βIII微管蛋白、NF-L和钙蛋白酶裂解150-kDaαII谱分解产物（SBDP150）的定量。n=每组3只小鼠。（H） Mfn2介导的神经肌肉突触保护作用的假设模型。首先，钙蛋白酶抑制剂在MAM上形成复合物。然后，可能通过MAM-Mfn2和线粒体Mfn2中的分子间相互作用，含有钙蛋白酶的MAM与线粒体相连，并通过移动线粒体沿轴突进一步转运。钙蛋白酶抑制剂向远端神经末梢的传递导致钙蛋白酶的局部抑制，最终防止轴突退化和神经肌肉突触丧失。所有印迹均加载等量的20μg蛋白质。数据为平均值±标准误差，代表三次试验。一元方差分析（ANOVA），然后进行Tukey多重比较测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.0001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Adachi Y、Ishida-Takahashi A、Takahashi C、Takano E、Murachi T、Hatanaka M。人造血系统细胞中钙蛋白酶抑制剂的磷酸化和亚细胞分布。生物化学杂志。1991;266:3968–3972.-公共医学
    1. Allen S、Heath PR、Kirby J、Wharton SB、Cookson MR、Menzies FM、Banks RE、Shaw PJ。家族性肌萎缩侧索硬化症细胞培养模型中细胞溶质蛋白质组的分析揭示了蛋白酶体、抗氧化防御和一氧化氮合成途径的改变。生物化学杂志。2003;278:6371–6383.-公共医学
    1. Arnold WD、Porensky PN、McGovern VL、Iyer CC、Duque S、Li X、Meyer K、Schmelzer L、Kaspar BK、Kolb SJ等，《脊髓肌萎缩的电生理生物标志物：临床前概念验证》。临床和转化神经学年鉴。2014;1:34–44.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Arnold WD、Sheth KA、Wier CG、Kissel JT、Burghes AH、Kolb SJ。小鼠后肢肌肉复合肌肉动作电位（CMAP）的电生理运动单位数估计（MUNE）测量。可视化实验杂志：JoVE 2015-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Averna M、de Tullio R、Passalacqua M、Salamino F、Pontremoli S、Melloni E。细胞内钙蛋白酶抑制剂定位的变化由可逆磷酸化介导。《生物化学杂志》2001；354:25–30.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型