Ube2v1-mediated ubiquitination and degradation of Sirt1 promotes metastasis of colorectal cancer by epigenetically suppressing autophagy

doi:10.1186/s13045-018-0638-9

.2018年7月17日；11(1):95.

doi:10.1186/s13045-018-0638-9。

Ube2v1介导的Sirt1泛素化和降解通过表观遗传抑制自噬促进结直肠癌转移

童申¹, 林东才¹, 刘玉红², 史丽¹, 甘文娟¹, 李秀明¹, 王靖如¹, 彭大国¹, 群周¹, 兴兴路¹, 李娜孙¹, 李建明^三

附属公司

¹苏州苏州大学医学院病理学系，215123，中华人民共和国。
²中国南方医科大学宝安医院病理科，深圳，518101。
^三苏州苏州大学医学院病理学系，215123，中华人民共和国。jianmingli@suda.edu.cn。

PMID： 30016968
预防性维修识别码：下午605692
内政部： 10.1186/s13045-018-0638-9

Ube2v1介导的Sirt1泛素化和降解通过表观遗传抑制自噬促进结直肠癌转移

童申等。血液肿瘤杂志. 2018.

.2018年7月17日；11(1):95.

doi:10.1186/s13045-018-0638-9。

作者

童申¹, 林东才¹, 刘玉红², 史丽¹, 甘文娟¹, 李秀明¹, 王敬如¹, 彭大国¹, 群周¹, 兴兴路¹, 李娜孙¹, 李建明^三

附属公司

¹苏州苏州大学医学院病理学系，215123，中华人民共和国。
²中国南方医科大学宝安医院病理科，深圳，518101。
^三苏州苏州大学医学院病理学系，215123，中华人民共和国。jianmingli@suda.edu.cn。

PMID： 30016968
预防性维修识别码： PMC6050692型
内政部： 10.1186/s13045-018-0638-9

摘要

背景：泛素化是细胞稳态的一种基本翻译后修饰，偶联酶（E2）家族的成员是泛素-蛋白酶体系统的关键组成部分。然而，E2家族在结直肠癌中的作用尚不清楚。我们的研究旨在研究泛素结合E2酶变异蛋白（Ube2v）之一的Ube2v1在CRC中的作用，该蛋白不含E2s催化活性所需的保守半胱氨酸残基。

方法：采用免疫组织化学和实时RT-PCR技术分别研究大肠癌组织中Ube2v1蛋白和mRNA水平的表达。采用Western blotting和免疫荧光、透射电镜和体内拯救实验研究Ube2v1对自噬和EMT程序的功能影响。采用定量质谱、免疫沉淀、泛素化分析、western blotting和实时RT-PCR分析Ube2v1对组蛋白H4赖氨酸16乙酰化、与Sirt1相互作用、Sirt1泛素化和自噬相关基因表达的影响。

结果：Ube2v1在CRC样本中升高，其表达增加与CRC患者生存率降低相关。Ube2v1促进体外CRC细胞的迁移和侵袭，促进体内CRC细胞肿瘤的生长和转移。有趣的是，Ube2v1在体内外以自噬依赖模式抑制自噬程序并促进上皮-间充质转化（EMT）和CRC细胞的转移。此外，雷帕霉素和海藻糖通过诱导正交异性小鼠异种移植肺转移模型中的自噬途径，减弱了增强的Ube2v1介导的肺转移。从机制上讲，Ube2v1促进Ubc13介导的Sirt1泛素化和降解，抑制组蛋白H4赖氨酸16乙酰化，最终表观遗传抑制CRC自噬基因的表达。

结论：我们的研究在功能上将泛素蛋白酶体系统中的E2成员Ube2v1与自噬程序联系起来，从而为发展针对CRC患者的Ube2v靶向治疗提供了线索。

关键词：自噬；大肠癌；上皮间质转化；转移；泛素结合E2酶。

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数字

图1
Ube2v1对结直肠癌自噬程序的影响。一,b条当Ube2v1过度表达时，通过western blot检测LC3-II、Beclin1和P62水平的蛋白表达(一)或被撞倒(b条)在正常培养条件下培养DLD-1和SW480细胞。**c（c）**当Ube2v1在Hank’s缓冲盐水（HBSS）中饥饿的DLD-1和SW480细胞中过度表达时，通过western blots检测LC3-II的蛋白表达。d日透射电镜（TEM）观察到正常条件下或饥饿条件下Ube2v1过表达稳定的细胞中对应自噬空泡的多泡结构扩大。**e（电子）**在抑制Ube2v1表达后，分析SW480细胞内源性LC3或P62点的免疫荧光染色。**（f）**将mCherry-GFP-LC3B报告子转染到细胞中，监测Ube2v1敲除或Torin（浓度）处理12 h后，自噬体从绿色荧光蛋白（GFP）自噬到红色荧光蛋白（RFP）自溶体的自噬过程

图2
Ube2v1对组蛋白H4赖氨酸16乙酰化和Sirt1表达的影响。一使用定量质谱分析对照细胞和Ube2v1稳定过表达的细胞之间的差异蛋白。b条,**c（c）**Ube2v1过度表达后，检测组蛋白提取物中组蛋白H4赖氨酸16乙酰化（H4K16ac）的表达(b条)或被撞倒(**c（c）**)在SW480和DLD-1单元中。d日,**e（电子）**Ube2v1过度表达后检测到Sirt1表达(d日)或被撞倒(**e（电子）**)在SW480和DLD-1单元中。**（f）**Ube2v1过表达对H4K16ac有无Sirt1过表达的影响

图3
Ubc13在Ube2v1中的作用介导了CRC细胞中Sirt1的泛素化。一免疫沉淀法检测转染Flag-Ube2v1和Myc-Sirt1的Ube2v1-Sirt1in SW480细胞之间的外源性相互作用。b条免疫沉淀法检测SW480细胞中Ubc13和Sirt1之间的外源性和内源性相互作用。**c（c）**与GFP-Ube2v1、HA-Ub、两个靶向Ubc13的siRNA或载体控制共转染的SW480细胞裂解液中内源性Sirt1的泛素化分析。在收获前用或不用MG132（20μM）处理细胞，然后用抗Sirt1抗体免疫沉淀细胞。d日与GFP-Ube2v1、HA-Ub、NSC697923（一种靶向Ubc13的小分子抑制剂）或DMSO对照物共转染的SW480细胞裂解液中内源性Sirt1的泛素化分析。在收获前用或不用MG132（20μM）处理细胞，然后用抗Sirt1抗体免疫沉淀细胞

图4
Ube2v1对结直肠癌上皮-间质转化和自噬程序的影响。一,b条在Ube2v1过度表达后，检测E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin、N-钙粘蛋白、Twist1和Snai1的表达(一)或被撞倒(b条)在DLD-1和SW480单元中。**c（c）**从小鼠异种移植物模型中提取的肿瘤用于通过蛋白质印迹检测具有Ube2v1稳定过表达的DLD-1和SW480细胞中E-钙粘蛋白和LC3-II的表达。d日通过免疫荧光分析，在SW480细胞中敲除Ube2v1后，观察内源性LC3点以及E-cadherin、β-catenin和Vimentin的表达。**e（电子）**使用RNA干扰技术敲除HCT116和SW480细胞中的Ube2v1，ATG5，ATG7，LC3-II，E-cadherin，β-catenin，Vimentin，Fibronectin和N-cadherin后，在有或没有敲除ATG5或ATG7的情况下观察到Ube2v 1的表达

图5
雷帕霉素对Ube2v1介导的CRC小鼠原位异种移植模型肺转移的影响。一静脉注射稳定过度表达Ube2v1（2×10）的SW480细胞小鼠的肺指数和肺转移结节数⁶细胞）已确定(n个 = 每组6个）。b条静脉注射SW480细胞后小鼠的肺指数和肺转移结节数稳定地降低了Ube2v1（2×10）的表达⁶细胞）已确定(n个 = 每组6个）。图示肺转移结节的代表性照片（箭头）。H&E染色显示肺转移细胞的典型显微照片，放大倍数为× 200.M转移灶，N邻近正常肺组织。在用雷帕霉素（终浓度10ng/ml）刺激或不用雷帕霉素（终浓度10ng/ml）刺激过表达Ube2v1后，检测E-钙粘蛋白和LC3-II的表达。**c（c）**图示肺转移结节的典型照片。d日H&E染色显示肺转移细胞的典型显微照片，放大倍数为× 100（左）和× 200（右）。**e（电子）**测定小鼠肺指数和肺转移结节数(n个 = 每组6个）。M转移灶，N邻近正常肺组织。误差线代表平均值 ± 统计学显著性由双尾、未配对的学生的t吨测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01.（f）通过免疫组织化学染色分析Ube2v1、Beclin1和E-cadherin的表达。误差线代表平均值 ± s.d.统计显著性由双尾、未配对学生的t吨测试*第页 < 0.05

图6
结直肠癌临床标本中Ube2v1的表达。一使用qPCR检测CRC患者肿瘤及其邻近组织中Ube2v1的mRNA水平。b条通过免疫组织化学染色对CRC患者配对、相邻正常和肿瘤组织样本的Ube2v1染色评分。CRC患者配对、相邻正常和肿瘤组织样本中Ube2v1的典型染色。**c（c）**通过免疫组织化学染色对有或无远处转移的CRC患者肿瘤样本中Ube2v1染色的评分。d日采用免疫组织化学染色法对不同TNM分期的CRC患者肿瘤样本中Ube2v1染色的得分。显示了TNM I期和IV期CRC患者肿瘤样本中Ube2v1的典型染色。**e（电子）**使用公共基因表达谱（GSE17537）数据，通过PrognoScan根据Ube2v1 mRNA的表达水平对CRC患者的无病生存率进行分析。使用双尾、未配对学生的t吨测试*第页 < 0.05

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