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.2018年10月；42(4):2053-2061.
doi:10.3892/ijmm.2018.3775。 Epub 2018年7月12日。

雷公藤红素对游离脂肪酸诱导的HepG2细胞中toll样受体4介导的炎症反应的影响

李平汉 1, 贝孙 1, 李春军 1, 谢云（音） 1, 李明晨 1
附属机构

雷公藤红素对游离脂肪酸诱导HepG2细胞toll样受体4介导的炎症反应的影响

李平汉等。 国际分子医学杂志. 2018年10月.

摘要

Toll‑like receptor 4（TLR4）介导的免疫和炎症信号在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制中起着关键作用。我们之前的研究表明，雷公藤红素治疗能够改善2型糖尿病大鼠的肝脏脂肪变性并抑制TLR4信号级联通路。本研究旨在研究雷公藤红素对脂肪变性HepG2细胞甘油三酯积累和炎症的影响，以及在体外通过小干扰RNA（siRNA）敲低TLR4基因后调节细胞反应的可能机制。通过将HepG2细胞暴露于不含或含有雷公藤红素的游离脂肪酸（FFA）中，制备肝脂肪变性细胞模型。油红O染色显示细胞内甘油三酯，并研究TLR4/髓样分化初级反应88（MyD88）/核因子‑κB（NF-κB）信号级联途径。为了直接阐明TLR4是否是雷公藤红素在FFA暴露时的阻断靶点，用TLR4 siRNA转染后测定了细胞对炎症的反应。结果显示，雷公藤红素显著减少了脂肪变性HepG2细胞中甘油三酯的积累，并下调了TLR4的表达水平，MyD88和磷酸化‑NF‑κBp65，以及下游炎性细胞因子白介素‑1β和肿瘤坏死因子α。TLR4的敲除也减轻了FFA诱导的炎症反应。此外，TLR4 siRNA和雷公藤红素的联合治疗进一步减弱了炎症介质的表达。这些结果表明，雷公藤红素通过抑制TLR4介导的脂肪性HepG2细胞的免疫和炎症反应发挥其部分保护作用。

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数字

图1
图1
FFA和雷公藤红素对HepG2细胞的细胞毒性作用。（A） 雷公藤红素的化学结构。为了确定后续实验的最佳浓度，FFA（0.25、0.5、1.0和2.0 mM）和雷公藤红素（0.1、0.2、0.5、1.01.5和2.0μM） 在HepG2细胞中进行了研究。HepG2细胞与指定浓度的（B）FFA和（C）雷公藤红素孵育24 h，并通过细胞计数试剂盒-8测定细胞活力。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=6）。*P<0.05和**P<0.01。游离脂肪酸。
图2
图2
雷公藤红素对FFA诱导HepG2细胞中甘油三酯积累的影响。通过将HepG2细胞暴露于0.5 mM FFA，然后与0.1、0.2和0.5孵育，制备肝脂肪变性细胞模型μM雷公藤红素24小时。油红O染色显示在（A）正常对照，（B）0.5 mM FFA，（C）0.5 mM-FFA+0.1μM雷公藤红素，（D）0.5 mM FFA+0.2μM雷公藤红素和（E）0.5 mM FFA+0.5μM组雷公藤红素（放大，x400）。红色箭头表示脂滴。（F） 通过酶法分析细胞内甘油三酯水平。数据显示为平均值的平均值±标准误差（n=6）。*P<0.05和**P<0.01。游离脂肪酸。
图3
图3
在FFA诱导的HepG2细胞中，塞拉斯托尔降低TLR4和下游信号因子。HepG2细胞用0.5μM雷公藤红素和0.5mM FFA持续24小时，并通过逆转录定量聚合酶链反应和蛋白质印迹分析炎症介质的转录物和蛋白质表达水平。（A） TLR4的相对mRNA和（B）蛋白表达水平。western blotting检测（C）MyD88、（D）磷酸化-NF-κBp65和总NF-κBp 65的相对蛋白表达水平（p-NF-κ的Bp65水平归一化为总NF-kb Bp 65%水平）、（E）IL-1β和（F）TNFα。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=6）。*P<0.05和**P<0.01。游离脂肪酸；TLR4，toll样受体4；MyD88，髓系分化初级反应88；核因子-κB；IL-1β、IL-1β；肿瘤坏死因子α。
图4
图4
TLR4 siRNA转染HepG2细胞的效果。为了选择最有效的TLR4 siRNA序列，三个FAM标记的TLR4-siRNA构建物被脂质体转染到HepG2细胞®2000.转染24小时后，在荧光显微镜下用FAM-siRNA测试转染效率（放大倍数x200）。（A） 细胞在普通光和FAM荧光灯下的可视化。细胞内的荧光颗粒表明siRNA已成功转染到HepG2细胞。（B） 分别用逆转录定量聚合酶链和western blotting分析TLR4的相对mRNA和（C）相对蛋白表达水平。（D） FFA+阴性对照siRNA和（E）TLR4 siRNA处理的HepG2细胞经油红O染色（放大，x400）。红色箭头表示脂滴。（F） 通过酶法分析细胞内甘油三酯水平。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=6）。*P<0.05和**P<0.01。游离脂肪酸；TLR4，toll样受体4；小干扰RNA；FAM，荧光素酰胺。
图5
图5
雷公藤红素和TLR4 siRNA对FFA诱导HepG2细胞中TLR4信号级联通路的影响。为了了解雷公藤红素改善脂肪性HepG2细胞炎症反应的相关机制，在暴露于BSA、0.5 mM FFA或FFA与0.5 mM的混合物后，下游炎症介质的表达水平μ在转染阴性对照siRNA或TLR4 siRNA的HepG2细胞中观察M celastrol 24 h。western blotting分析（A）MyD88、（B）phospho-NF-κBp65和总NFκBp 65的相对蛋白表达水平（p-NF-κ子Bp65归一化为总NF-κ子Bp65水平）、（C）IL-1β和（D）TNFα。数据表示为平均值的平均值±标准误差（n=6）。*P<0.05和**P<0.01。游离脂肪酸；TLR4，toll样受体4；小干扰RNA；MyD88，髓系分化初级反应88；核因子-κB；IL-1β、IL-1β；肿瘤坏死因子α。
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