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.2018年8月；50(8):1086-1092.
doi:10.1038/s41588-018-0170-4。 Epub 2018年7月16日。

Krebs-cycle-deficient遗传性癌症综合征定义为同源重组DNA修复缺陷

帕克·苏尔科夫斯基 1 2, Ranjini K Sundaram公司 1, 塞巴斯蒂安·欧克 1 三, 克里斯托弗·D·科尔索 1 4, 刘延峰 1, 塞斯·努尔巴赫什 1, 莫妮卡·尼日尔 1 5, 玛尔塔·博克 6, 上野大树 6, 阿拉文德·南比亚尔·卡拉蒂尔 1, 荀宝 7, 李静（音译） 7, 布莱恩·舒克 8, 兰吉特·宾德拉 9 10, 彼得·M·格雷泽 11 12
附属公司

Krebs-cycle-deficient遗传性癌症综合征定义为同源重组DNA修复缺陷

帕克·L·苏尔科夫斯基等。 自然基因. 2018年8月.

摘要

遗传性癌症综合征遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）和琥珀酸脱氢酶相关遗传性副神经节瘤和嗜铬细胞瘤（SDH-PGL/PCC）与编码克雷布斯循环酶富马酸水合酶和琥珀酸酯脱氢酶基因的种系失能突变有关，从而导致富马酸和琥珀酸水平分别升高1-3在这里，我们报告了富马酸和琥珀酸均抑制了DNA双链断裂（DSB）解析和基因组完整性维护所需的同源重组（HR）DNA修复途径，从而使肿瘤细胞容易受到聚（ADP）-核糖聚合酶（PARP）抑制剂的合成靶向作用。这些结果确定HLRCC和SDH PGL/PCC为家族性DNA修复缺陷综合征，为解释其癌症易感性提供了机制基础，并为晚期HLRCC及SDH PGL/PCC提供了潜在的治疗方法，这两种疾病在转移时均无法治愈。

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竞争性金融利益。

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。患者源性HLRCC和PGL/PCC肿瘤中高水平的琥珀酸或富马酸与DNA双链断裂升高相关
（a） 如图所示，液相色谱-质谱（LC/MS）对琥珀酸和富马酸进行定量，并通过中性彗星试验对一系列人类肿瘤样本和正常组织样本中的DNA双链断裂（DSB）进行定量。对于LC/MS n=1；对于中性彗星测定，每个临床样本n=3个重复；条形代表平均+/-扫描电镜（SEM）。（b）研究的患者衍生肿瘤样本的临床特征。（c） 中性彗星分析的代表性图像，作为对人类肿瘤样本和正常组织进行DNA DSB的测量，如面板a中的定量。对于每个临床样本，该分析重复3次。
图2
图2。琥珀酸脱氢酶或富马酸水合酶缺乏导致同源重组（HR）DNA修复减少，DNA双链断裂增加，DNA损伤反应灶增加
（a） 在YUNK1细胞中SDHB或FH敲低的组成型shRNA模型中，以及在患者来源的FH缺陷的HLRCC细胞系UOK 262（FH−/−）、UOK 268（FH p.His192Asp）和NCCFH1（FH−/−）中SDHB和FH表达的蛋白质印迹分析。该分析独立进行了3次，结果相似，图像围绕已知的感兴趣条带分子量进行裁剪。完整的斑点出现在补充图6中。（b和c）在YUNK1细胞和HLRCC细胞系中SDHB和FH被击倒后，LC/MS定量（b）琥珀酸和（c）富马酸。（d） 与核心HR因子BRCA1、BRCA2和RAD51的敲除相比，在有或无SDHB或FH敲除的YUNK1细胞中中性彗星分析的定量。（e） 在有（+FH）或无（+FF）的HLRCC患者衍生细胞系中进行中性彗星试验的量化FH公司质粒互补。（f） 在HEK293FT细胞中进行的γH2AX病灶染色的代表性图像和（g）量化，包括或不包括指示因子的敲除。定量SDHB和FH敲除的YUNK1 shRNA模型、HLRCC细胞系（UOK 262、UOK 288和NCCFH19）中的（h）γH2AX和（i）p53BP1病灶，以及YUNK1-细胞中核心HR因子的siRNA抑制。（j） 基于荧光素酶的质粒再激活试验报告HR瞬时转染或不转染表达质粒的患者源性HLRCC细胞系FH公司用于补充FH公司缺乏。（n） DR-GFP分析报告U2OS细胞中的HR。（o） 用靶向SDHB或FH以及核心HR因子的siRNA转染U2OS细胞后DR-GFP HR检测的定量。（p） 对YUNK1和HEK293FT细胞经2Gy IR处理后，无论是否抑制SDHB或FH的shRNA，RAD51病灶形成的量化。（q） RAD51在YUNK1细胞2Gy IR上形成病灶的典型图像，有或没有SDHB或FH的shRNA抑制。该分析重复3次，定量如面板p所示。对于b、c、d、e、g、h、i、k、l、m、o和p，统计分析采用双侧t检验（df=4）；条形代表3个独立实验+/-SEM的平均值。
图3
图3。高水平的琥珀酸和富马酸抑制同源重组，并在赖氨酸脱甲基酶KDM4A和KDM4B介导的途径中诱导DNA双链断裂升高
（a） 使用指定剂量的指定代谢物治疗24小时后，对U2OS DR-GFP HR分析进行量化。（b） 用2 mM琥珀酸盐、2 mM单乙基琥珀酸酯、2 mM-丁二酸二甲酯、1 mM丁二酸二甲酯或60µM丁二酸酯处理24小时后，通过HR定量YUNK1细胞中荧光素酶的复活。（c-d）在使用指定剂量的（c）丁二酸二甲酯和（d）琥珀酸治疗24小时后，对YUNK1细胞进行中性彗星试验的量化。（e） HEK293FT细胞经2 mM琥珀酸盐（Succ）或30 uM二甲基富马酸盐（Fum）处理24h后，进行γH2AX免疫荧光染色或DAPI DNA染色的代表性图像和相应定量。该分析独立进行了3次，结果相似，量化如f.（f）用指定剂量的代谢物处理的HEK293FT细胞中（f）γH2AX和（g）p53BP1病灶的量化所示。（h） 对UOK 262和UOK 268 HLRCC细胞系进行中性彗星试验的量化，该细胞系使用或不使用FH表达构建物进行瞬时转染，或使用指定剂量的琥珀酸或丁二酸二甲酯或DMSO对照进行24小时处理。（i） Western blot分析正常肾脏和PGL/PCC和HLRCC肿瘤患者衍生样品中组蛋白3赖氨酸36三甲基化（H3K36me3）和组蛋白3赖氨酸9三甲基化水平（H3K9me3），并对相应样品进行编号，如图1所示。Actin用作加载控件，YUNK shSDHB1用作控件。该分析独立进行了2次，结果相似，图像围绕感兴趣条带的已知分子量进行裁剪。完整的斑点出现在补充图6中。（j） 在HLRCC细胞系UOK 262和UOK 268中进行中性彗星分析的量化和代表性图像，使用或不使用FH、KDM4A、KDM4 B或KDM4C表达载体转染，或使用2mM二甲基-α-酮戊二酸（αKG）处理。（k） 在用指定剂量的代谢物处理24小时、同时转染或不转染KDM4A表达构建体或用2mM二甲基-α-酮戊二酸处理的YUNK1细胞中进行的中性彗星测定的定量。（l） 用指定剂量的琥珀酸二甲酯、呋喃甲酸二甲酯和/或α-酮戊二酸二甲酯治疗后进行DR-GFP分析。对于a、b、c、d、f、g、h、j、k和l，采用双侧t检验进行统计分析（df=4）；条形图表示3个独立实验的平均+/-SEM。
图4
图4。SDHB或FH缺乏对培养的人类细胞和小鼠的人类肿瘤异种移植物赋予PARP抑制剂敏感性
（a–b）HEK293FT细胞中对PARP抑制剂（a）奥拉帕利（Olaparib）和（b）BMN-673的反应进行克隆生存分析，包括或不包括SDHB或FH的敲除，或使用或不使用2 mM琥珀酸或60µM丁二酸二甲酯治疗，如图所示。（c） 在肾源性细胞系中对BMN-673指示剂量的反应进行克隆存活分析。对于a、b和c，圆点表示3个独立复制+/-SEM的平均值。（d–f）（d）shSDHB-表达（f（1234）=40.61）、（e）shFH-表达（f⑴，144）=15.71）和（f）用BMN-673或载体对照治疗的裸鼠HEK293FT肿瘤异种移植物中的肿瘤生长延迟试验。（g–i）（g）shSDHB表达的肿瘤生长延迟分析（ANOVA F（1,90）=28.58），（h）shFH表达的肿瘤（ANOVAF（1,126）=20.49），以及（i）用BMN-673或载体对照治疗的非靶向对照shCTRL表达的HEK293FT异种移植物瘤。当肿瘤平均大小达到95–150 mm时开始治疗三（箭头）。d、e和f组中每组有10只动物，g、h和I组中每组10只动物各有一个肿瘤。（j） LC/MS定量HEK293FT shSDHB和shRNA控制的异种移植瘤中BMN-673的积累（约80 mm治疗时的大小三)如图所示，单剂量BMN-673治疗小鼠24小时后，条形代表平均+/-SEM，n=3。通过双边t检验进行统计分析，df=4。（k） 单剂量BMN-673治疗24小时后，通过ELISA定量HEK293FT shSDHB和shRNA对照异种移植瘤中的总多聚ADP-核糖（PAR）水平，bars表示平均+/-SEM，n=6，通过双侧t检验进行统计分析，df=10。（l） 植入后4天开始用Olaparib或载体对照治疗的裸鼠中患者衍生HLRCC UOK 262异种移植瘤的肿瘤生长延迟试验（箭头）（ANOVA F（1532）=185.2）。（m） 患者衍生的HLRCC UOK 262异种移植瘤在裸鼠体内的肿瘤生长延迟试验，在肿瘤平均大小达到250 mm时开始使用BMN-673或载体对照三（方差分析F（148）=8.79）。对于l，每组10只小鼠，对于m，每组6只小鼠。对于d、e、f、g、h、I、l和m中显示的所有肿瘤生长延迟曲线，点表示平均+/-SEM，p值通过方差分析确定。对于d、e、f、g、h、i、l、m，箭头表示治疗开始。（n） 提出了琥珀酸和富马酸通过抑制KDM4A/B导致PARP抑制剂合成致死性而诱导HR抑制的模型。
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    朱莉、洪毅、朱Z、黄杰、王杰、李刚、吴X、陈毅、徐毅、郑莉、黄毅、孔伟、薛伟、张杰。 朱莉等。 细胞死亡疾病。2024年2月19日；15(2):151. doi:10.1038/s41419-024-06510-2。 细胞死亡疾病。2024 PMID：38374146 免费PMC文章。
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