A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality

doi:10.1016/j.cell.2018.06.035

.2018年7月12日；174（2）：465-480.e22。

doi:10.1016/j.cell.2018.06.035。

一套具有增强脑细胞类型靶向性和功能性的转基因驱动和报告小鼠系

坦尼亚·戴格尔¹, 琳达·马迪森¹, 特拉维斯·A·黑格¹, 马修·T谷¹, Ulf Knoblich公司¹, 莱兰·S·拉森¹, 马克·马库诺¹, 劳伦斯·黄¹, 洪谷¹, 拉切尔·拉森¹, 玛雅·米尔斯¹, 爱丽丝·博斯玛-穆迪¹, La’Akea Siverts公司¹, 米兰达·沃克¹, 卢卡斯·格雷巴克¹, 姚紫珍¹, 奥利维娅·方¹, 图克·Nghi Nguyen¹, 艾玛·加伦¹, Garreck H Lenz公司¹, 玛丽亚·查瓦尔哈², 朱莉·彭德格拉芙¹, 詹姆斯·哈林顿¹, 卡拉·平川（Karla E Hirokawa）¹, 朱莉·A·哈里斯¹, 菲利普·尼科维奇¹, 美狄亚J麦格劳¹, 道格拉斯·R·奥勒伦肖¹, 金伯利·A·史密斯¹, 克里斯托弗·贝克¹, Jonathan T Ting（乔纳森·丁）¹, 苏珊·M·桑金¹, 杰罗姆·莱科克¹, 迈克尔·Z·林², 爱德华·博伊登^三, 盖布·J·墨菲¹, 努诺·M·达·科斯塔¹, 杰克·沃特斯¹, 陆莉¹, Bosiljka Tasic公司¹, 曾洪奎⁴

附属公司

¹美国华盛顿州西雅图艾伦脑科学研究所，邮编98109。
²斯坦福大学医学院神经生物学和生物工程系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
^三麻省理工学院媒体实验室和麦戈文研究所，生物工程系、脑与认知科学系，麻省理学院，剑桥，马萨诸塞州02139，美国。
⁴美国华盛顿州西雅图艾伦脑科学研究所，邮编98109。电子地址：hongkuiz@alleninstitute.org。

采购管理信息： 30007418
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内政部： 2016年10月10日/j.cell.2018.06.035

一套具有增强脑细胞类型靶向性和功能性的转基因驱动和报告小鼠系

塔尼亚·L·戴格尔等。单元格. 2018.

.2018年7月12日；174（2）：465-480.e22。

doi:10.1016/j.cell.2018.06.035。

作者

坦尼亚·戴格尔¹, 琳达·马迪森¹, 特拉维斯·A·黑格¹, 马修·T谷¹, Ulf Knoblich公司¹, 莱兰·S·拉森¹, 马克·马库诺¹, 劳伦斯·黄¹, 洪谷¹, 拉切尔·拉森¹, 玛雅·米尔斯¹, 爱丽丝·博斯玛-穆迪¹, La’Akea Siverts公司¹, 米兰达·沃克¹, 卢卡斯·格雷巴克¹, 姚紫珍¹, 奥利维娅·方¹, Thuc Nghi Nguyen先生¹, 艾玛·加伦¹, Garreck H Lenz公司¹, 玛丽亚·查瓦尔哈², 朱莉·彭德格拉芙¹, 詹姆斯·哈林顿¹, 卡拉·E·广川¹, 朱莉·A·哈里斯¹, 菲利普·尼科维奇¹, Medea J McGraw公司¹, 道格拉斯·R·奥勒伦肖¹, 金伯利·A·史密斯¹, 克里斯托弗·贝克¹, Jonathan T Ting（乔纳森·丁）¹, 苏珊·M·桑金¹, 杰罗姆·莱科克¹, 迈克尔·Z·林², 爱德华·博伊登^三, 盖布·J·墨菲¹, 努诺·M·达·科斯塔¹, 杰克·沃特斯¹, 陆莉¹, Bosiljka Tasic公司¹, 曾洪奎⁴

附属公司

¹美国华盛顿州西雅图艾伦脑科学研究所，邮编98109。
²斯坦福大学医学院神经生物学和生物工程系，斯坦福，加利福尼亚州94305，美国。
^三麻省理工学院媒体实验室和麦戈文研究所，生物工程系、脑与认知科学系，麻省理学院，剑桥，马萨诸塞州02139，美国。
⁴美国华盛顿州西雅图艾伦脑科学研究所98109电子地址：hongkuiz@alleninstitute.org。

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内政部： 2016年10月10日/j.cell.2018.06.035

摘要

现代遗传学方法在获取大脑中不同类型的细胞以及促进对其功能的研究方面具有强大的作用。在这里，我们报告了一大组驱动和报告转基因小鼠系，包括23个针对各种皮层和皮层下细胞群的新驱动系和26个表达一系列分子工具的新报告系。特别是，我们描述了TIGRE2.0转基因平台，并引入了Cre依赖型报告系，该报告系能够实现光学生理学、光学遗传学和基因定义细胞群的稀疏标记。TIGRE2.0报告员打破了广泛神经元类型中单拷贝靶向插入转基因的转基因表达水平的障碍，以及与我们的第一代TIGRE品系相比简化育种策略的额外优势。这些新型转基因株极大地扩展了可用于有效识别、监测和操纵小鼠大脑中不同细胞类型的高精度遗传工具的储备。

关键词：Cre；Flp；老虎；钙传感器；细胞类型；沟道视紫红质；光遗传学；记者；转基因小鼠；电压传感器。

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权益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。针对大脑中特定细胞群的新型Cre和Flp驱动线**
另见表S1和S3。(A类)使用每块面板上所示的tdTomato报告探针或Cre探针，从所有新驱动线的ISH特征中选择图像。完整的ISH数据集可在以下位置查看：http://connectivity.brain-map.org/转基因Ai14用于检测所有Cre系，Ai65F用于所有FlpO系。唯一的例外是Tnnt1-IRES2-CreERT2，它与一个新的TIGRE2.0报告者Ai140交叉，TissueCyte成像显示丘脑神经元极为稀疏的GFP标记（在P10诱导1天后）。有关地区首字母缩写词，请参阅STAR方法。(B类)检查皮质层特异性驱动线示例中的兴奋性和抑制性神经元标记。dFISH在VISp中的代表性图像，使用tdTomato报告子（绿色）和pan-GABA能标记*加德1*（红色）探头，如图所示。报告基因在抑制性神经元中的表达程度从无（Plxnd1-IRES2-dgFlpO，Rorb-P2A-FlpO）到少数细胞（Rasgrf2-T2A-dgFlpO），再到许多细胞（Calb1-IRES2-Cre）不等。

**图2。用于光遗传学和超微结构标记的新TIGRE1.0报告基因系**
另请参见表S2和图S1。(A类)依赖Cre和tTA的交叉TIGRE1.0报告系设计和广义三重转基因育种方案。(B类)四条新TIGRE1.0报告线的配置。(C类)皮层第6层和第4层神经元视蛋白的稳健Cre/tTA依赖性表达。(D类)DAB-Ni染色显示APEX2活性。亮场图像显示位于多个皮层区域的神经元的体细胞、树突状细胞和轴突细胞内的染色，包括VISp的第4层（放大图像）。(**E–G公司**)电子显微镜显示突触前和突触后终末的APEX2依赖性标记。示例包括标记的树突（b）和未标记的脊椎（sp）（E）之间的突触（箭头），标记的树干和标记的脊椎动物（F）之间的联会，以及标记的树突和未标记树突轴（d）（G）之间的连会。(**H–I型**)电子显微镜显示APEX依赖性标记细、无髓（H）或有髓（I）轴突（箭头）。

**图3。TIGRE2.0线在多种细胞类型中显示增强表达**
另请参见表S2和图S2–S3。(A类)Cre-dependent TIGRE2.0报告系设计和简化的双转基因育种方案。给双转基因小鼠注射强力霉素（DOX）可以抑制tTA2活性和随后TRE2启动子驱动的表达。(B类)Cre VISp中天然EGFP和td番茄荧光的代表性图像；Ai139双转基因小鼠。(C类)Ntsr1-Cre_GN220的VISp中天然EGFP和td番茄荧光的代表性图像；有或没有DOX的Ai139小鼠。(D类)来自Cre的VISp中Ai140的结构和天然EGFP荧光的代表性图像；Ai140只小鼠。(E类)GCaMP6表达TIGRE2.0报告线的配置。(F类)Cre中天然GCaMP6f和td番茄荧光的代表性图像；Ai14；Ai148小鼠表现出分层特异性表达模式。(**G公司**)显示的三重或双转基因小鼠主要抑制神经元类别中天然GCaMP6和td番茄荧光的代表性图像。(**H（H）**)天然GCaMP6f荧光的共定标和相应Cre中主要神经调节标记物的免疫染色；Ai148小鼠（胆碱能抗-ChAT、多巴胺能抗-TH、去甲肾上腺素能抗-NET和抗-TH，5-羟色胺能神经元抗-TPH2和抗-SERT）。有关地区首字母缩写词，请参阅STAR方法。(我)Cre-defined cell classes中GCaMP6表达细胞的量化。对于皮层中间神经元类(上海,贵宾和*Pvalb公司*)，在VISp中量化天然GCaMP6与tdTomato（来自Ai14）的共表达，并以tdTomato+细胞数量的百分比表示。对于神经调节神经元类型，H中天然GCaMP6f与所示细胞类型特异标记的共同表达以标记阳性细胞数量的百分比表示。数据以平均值±s.e.m表示（与J相同）；n=3-5只小鼠。(J型)GCaMP6s和td番茄在*Pvalb公司*+Pvalb-IRES-Cre（抗PV标记）细胞；Ai163只小鼠（n=3-4）。

**图4。TIGRE2.0报告基因系表现出高水平的转基因表达**
另请参见图S4和表S4。(A类)表示TIGRE2.0报告线的视蛋白或电压指示器的配置。(B类)Cux2-CreERT2中天然ChrimsonR-tdT和GCaMP6f荧光的代表性图像；Ai93；低剂量三苯氧胺诱导的Ai167小鼠。(C类)抗2A肽染色显示oChIEF在Cux2-CreERT2中的表达及其与tdTomato的共定位；Ai168小鼠。(D类)Ai169和Ai170中天然ASAP2s和ASAP2s-Kv荧光的代表性图像与Cux2-CreERT2交叉。(E类)通过单细胞RNA-seq定量报告转基因的mRNA水平。每个单元格的规范化表达式值显示为每千基百万读片段数（FPKM）。将从各种Cre x TIGRE2.0小鼠或AAV注射小鼠分离的细胞中的转基因表达水平与相应Cre x Ai14小鼠的对照细胞进行比较。Snap25-IRES2-Cre；将Ai14和Snap25-IRES2-Cre AAV细胞分为谷氨酸能（Glu）组和GABA能（GABA）组进行比较。

**图5。体内TIGRE2.0 GCaMP6小鼠皮层神经元的2P钙成像**
另请参见图S5。(A类)Sst的2P-Ca成像；Ai14；Ai148个神经元。左：Z投影图像（时间序列），显示软脑膜表面下212μm处的整个视野（400×400μm）。右图：7中250秒成像的ΔF/F记录道上海左侧面板中标记的神经元。还显示了视觉刺激的时间进程和跑步速度。B和C相同(B类)Vip的2P-Ca显像；Ai14；192μm深处的Ai148个神经元。注意，荧光变化在开始运行之前开始。(C类)Pvalb的2P-Ca成像；280μm深处的Ai163个神经元。(D类)改进了中GCaMP6f的功能上海Ai148中的细胞相对于Ai95，如平均最大响应（左）、灰度屏幕期间ΔF/F的标准偏差（零刺激，中间）和估计的信噪比（右）的总体直方图所示。(E类)中GCaMP6功能的比较*Pvalb公司*Ai148、Ai162和163小鼠的细胞。

**图6。视蛋白表达的TIGRE1.0和TIGRE2.0细胞的光诱发反应特征**
检测的小鼠系为Scnn1a-Tg3-Cre；ROSA26-ZtTA；Ai90（简化为Scnn1a-Ai90或Ai90，下同）、Scnn1a-Tg3-Cre；ROSA26-ZtTA；Ai134，Scnn1a-Tg3-Cre；ROSA26-ZtTA；Ai136，Scnn1a-Tg3-Cre；Ai167和Scnn1a-Tg3-Cre；Ai168。另请参见图S6。(A类)100-ms刺激下的光诱发电流的典型示例（用灰色阴影表示）。痕迹来自单个神经元，并归一化为其峰值电流振幅。(B类)来自每个转基因系的单个细胞的峰值电流幅度和数据点的平均值±s.d。Ai90:0.59±0.36毫安；Ai134:0.88±0.36毫安；Ai136:2.76±1.34nA；Ai167:1.99±0.50 nA；Ai168:0.19±0.18毫安**P（P）*<0.005（n=每行6–10个单元格）。(C类)每个转基因株系的光电流激活的功率依赖性。数据绘制为平均值±标准差。功率小于1 mW/mm时产生的电流振幅²由于振幅较低，Ai168线未进行量化。(D类)Scnn1a-Tg3-Cre的代表性反应；Ai167电池以5毫秒的光脉冲增加功率。(E类)针对每个转基因系的光刺激功率绘制的累积尖峰概率。(F类)转基因品系之间高频放电的比较。单个细胞在指示频率下对10次重复刺激的代表性电压记录。(**G公司**)每个转基因株系的AP保真度与刺激频率的关系图。数据绘制为平均值±标准误差（n=每条线9–15个单元格）。

**图7。大脑皮层泛兴奋性GCaMP6表达小鼠大脑皮层异常活动的发生率**
另请参见图S7和表S5-S6。宽视野钙成像检查大脑皮层的发作间期活动。每个鼠标线都显示了一个或两个代表性示例。对于每只小鼠，左面板显示来自皮层背表面的GCaMP6荧光，中面板显示来自运动皮层某个位置的30秒钙活性示例痕迹（左面板中的红点），右面板显示事件幅度（突起）和事件宽度之间的关系（六边形散点图）。(A类)7个Slc17a7-IRES2-Cre中没有一个；受检的Ai162小鼠有异常活动。(B类)在7个Slc17a7-IRES2-Cre中有3个检测到异常活性；检查了148只小鼠，其中一只是右侧显示的2号小鼠。(C类)在5个Slc17a7-IRES2-Cre中有1个检测到异常活性；Camk2a-tTA；检查了93只小鼠，这是右侧显示的2号小鼠。(D类)Emx1-IRES-Cre示例；Camk2a-tTA；具有异常活动的Ai93小鼠。(E类)唯一的Emx1-IRES-Cre；Camk2a-tTA；我们检测的Ai94小鼠表现出异常活动（显示的区域是体感皮层）。注意GCaMP6f（D）或GCaMP6s（E）指示器报告的事件特征的差异。

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中的注释

转基因工具箱在小鼠中的扩展。
Vogt N.公司。 Vogt N.公司。自然方法。2018年9月；15(9):651. doi:10.1038/s41592-018-0124-x。自然方法。2018 采购管理信息：30171248 没有可用的摘要。

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