E47 Governs the MYC-CDKN1B/p27KIP1-RB Network to Growth Arrest PDA Cells Independent of CDKN2A/p16INK4A and Wild-Type p53

doi:10.1016/j.jcmgh.2018.05.002

.2018年5月16日；6(2):181-198.

doi:10.1016/j.jcmgh.2018.05.002。 2018年eCollection。

E47管理MYC-CDKN1B/p27^{知识产权1}-独立于CDKN2A/p16的生长抑制PDA细胞的RB网络^{INK4A（墨水）}和野生型p53

附属公司

¹加利福尼亚州拉荷亚桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所开发、老化和再生项目。
²医学院计算生物学和生物信息学中心。
^三摩尔癌症中心肿瘤外科手术部。
⁴基因组学核心，Sanford Burnham Prebys医学发现研究所，加利福尼亚州拉霍亚。
⁵加州大学圣地亚哥分校儿科，拉荷亚，加利福尼亚州。

PMID： 30003124
预防性维修识别码： PMC6039985型
内政部： 2016年10月10日/j.jcmgh.2018.05.002

E47管理MYC-CDKN1B/p27^{知识产权1}-独立于CDKN2A/p16的生长抑制PDA细胞的RB网络^{INK4A（墨水）}和野生型p53

凯萨琳·M·斯卡利等人。细胞分子胃肠肝素. 2018.

.2018年5月16日；6(2):181-198.

doi:10.1016/j.jcmgh.2018.05.002。 2018年eCollection。

附属公司

¹加利福尼亚州拉荷亚桑福德-伯纳姆-普雷比斯医学发现研究所开发、老化和再生项目。
²医学院计算生物学和生物信息学中心。
^三摩尔癌症中心外科肿瘤科外科。
⁴基因组学核心，加利福尼亚州拉荷亚市桑福德·伯纳姆·普雷比斯医学发现研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute，La Jolla，California）。
⁵加州大学圣地亚哥分校儿科，拉荷亚，加利福尼亚州。

PMID： 30003124
预防性维修识别码： PMC6039985型
内政部： 2016年10月10日/j.jcmgh.2018.05.002

摘要

背景和目标：KRAS中的癌基因突变与p53、CDKN2A/p16失活^{INK4A（墨水）}和SMAD4，推动胰腺导管腺癌（PDA）的进展。MYC的过度表达和视网膜母细胞瘤（RB）的解除进一步促进细胞增殖，并使确定治疗性改变PDA细胞周期控制途径的方法成为一项重大挑战。我们之前的研究表明，碱性helix-loop-helix转录因子E47可在体内外诱导PDA细胞的稳定生长停滞。在这里，我们确定了E47在低流量、患者来源的原代和已建立的PDA细胞系中诱导生长停滞的分子机制。

方法：RNA测序用于分析5个PDA细胞系中的E47依赖转录体。基因本体分析确定细胞周期控制是变化最大的途径。使用小干扰RNA/短发夹RNA敲除、小分子抑制剂和病毒表达来检测E47依赖性基因在细胞周期阻滞中的功能。细胞形态、分子标记的表达和衰老相关的β-半乳糖苷酶活性测定确定了细胞衰老。

结果：E47通过降低MYC的表达，增加CDKN1B/p27的水平，一致抑制PDA细胞周期的进展^{知识产权1}，恢复RB抑癌功能。E47引起这些变化的分子机制包括改变MYC和CDKN1B/p27的RNA转录水平和蛋白质稳定性^{知识产权1}在细胞水平上，E47诱导了一种以衰老相关β-半乳糖苷酶活性增加和衰老标记表达改变为特征的衰老样表型。

结论：E47控制着一个高度保守的细胞周期控制基因网络，包括MYC、CDKN1B/p27^{知识产权1}和RB，可在缺乏CDKN2A/p16的PDA细胞中诱导衰老样程序^{INK4A（墨水）}和野生型p53。RNA测序数据可在国家生物技术信息中心GEO获取，网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站/; 注册号：GSE100327。

关键词：CDK，细胞周期依赖性激酶；CDKN1B/p27KIP1、CDKN1 B/p27激酶抑制蛋白1；CDKN2A/p16INK4A，CDKN2A/p16 CDK 4A抑制剂；CEBP-α，CCAAT/增强子结合蛋白α；CENP-A，着丝粒蛋白A；细胞周期素依赖激酶抑制剂1；细胞周期；DDR，DNA损伤反应；ERK，细胞外信号调节激酶；GO，基因本体论；INK，CDK抑制剂；激酶抑制蛋白；MSCV，小鼠干细胞病毒；OIS，肿瘤诱导衰老；聚合酶链反应；PDA，胰腺导管腺癌；胰腺导管腺癌；视网膜母细胞瘤；RNA-seq，RNA测序；SA-βgal，衰老相关β-半乳糖苷酶；SKP、S相激酶相关；衰老；bHLH；bHLH，基本螺旋-环-螺旋；lfdr，局部错误发现率；mRNA、信使RNA；shRB，针对RB的短发夹RNA；shRNA、短发夹RNA；si-p27，针对p27的小干扰RNA。

PubMed免责声明

数字

图1
**E47抑制5种遗传多样性已建立和患者衍生的原代PDA细胞系的增殖。**(A类)外显子组测序确定了1334和779e基本系中4个最常见的驱动基因座的遗传状态。S215*为过早截断。关于BxPC-3、MIA-PaCa-2和PANC-1细胞的信息。(B类)PCR扩增的基因组DNA的Sanger测序证实了最初通过外显子组测序鉴定的突变。KRAS基因座含有一个G12V突变，在1334个细胞中表现为单等位基因。(C类)在1334个细胞中，错义突变导致p53位点的R175H。在779e细胞中，错义突变导致R209K，随后是一个碱基插入，产生N210K、T211H、F212F、R213S、H214T和提前终止S215*。(D类)25μg全细胞提取物的Western blot。(E类)长时间暴露全长p53印迹。用小鼠抗p53抗体（Ab-6克隆DO-1，M-187-P0；新标记物，加利福尼亚州弗里蒙特）检测779e全细胞提取物中未检测到p53。(F类)PDA细胞系感染一种编码全长人类E47的逆转录病毒，该逆转录病毒融合到小鼠雌激素受体配体结合域，经修饰后对三苯氧胺产生反应，然后选择人类CD25，如前所述。用4μm 4-羟基三苯氧胺处理所选细胞48–72小时，以诱导E47融合蛋白的核定位。(*G公司*)等量的细胞被培养、处理以诱导E47并计数。数据表示由一个未配对的t吨测试。误差线为±SEM(*H（H）*)如前所述，通过流式细胞术确定细胞周期特定阶段的细胞百分比。HD，纯合缺失；WT，野生型。

图2
**RNA-seq分析表明，E47系统地改变了大量细胞周期控制基因的表达。**(A类)主成分分析确定了高度一致的三重性(*重叠的圆*)与E47诱导反应的相似性(箭头)在5个细胞系中。(B类)所有基因的火山图(黑色和*洋红色圆点*)将统计学显著性（lfdr）与E47反应的变化幅度（log₂[含他莫西芬（WT）/不含他莫西芬（[NT）]）。转录水平出现统计显著变化的基因表示为*洋红色圆点*s.WT诱导E47核定位，NT为对照。(C类)根据RNA-seq测定，997个基因在所有5个细胞系中的转录水平发生了统计上最显著的变化(秒₅>100，请参阅“材料和方法”部分）。(D类)使用PCR阵列验证了最初通过RNA-seq鉴定的一些细胞周期调节因子的表达变化。(E类)生物过程类别中的GO术语来源于对997个基因的条件GO分析秒₅ > 100. (F类)GO所有基因成员转录水平的变化参与有丝分裂细胞周期G1/S转变的转录调控。(*G公司*)GO项G2/M检查点所有基因成员的转录水平变化。

图3
**在PDA细胞中，E47指导了一个控制细胞周期进展的基因表达综合程序。**(*A–E*)KEGG细胞周期途径反映了基于RNA-seq数据的每个细胞系中细胞周期控制基因表达的E47依赖性改变。(F类)E47诱导后的Western blot分析显示CDKN1A/p21增加^CIP1级蛋白质。(*G公司*)E47诱导后的Western blot分析显示CDKN1B/p27增加^{知识产权1}. (*H（H）*)shRNA敲除CDKN1B/p27^{知识产权1}核E47诱导后，PANC-1/E47细胞中Ki67阳性细胞数量增加。数据表示6个独立字段的平均值，每个字段至少有100个单元格，由未配对的t吨测试。误差线为±SEM(我)左侧：Western blot分析显示，p53-pSER15对2×1610 cGy的γ射线照射（连续2天使用Gammacell40 Exactor、研究辐射器和铯137辐射源照射20分钟）诱导DDR反应增加。第二次暴露后3小时收集细胞。赖特：Western blot分析显示p53-pSER15在E47诱导下没有增加。***P（P）*≤ .01. ∗∗∗∗*P（P）*≤ .0001.

图4
**E47改变了细胞衰老生物标志物在衰老方向的表达。**(A类)用与Alexa 488结合的小麦胚芽凝集素染色细胞膜糖蛋白后测量细胞大小。中位数细胞大小根据像素数进行量化，*P（P）*值通过Mann-Whitney检验确定，盒代表中间的两个四分位数，以及*胡须末端*表示最小和最大数据点。在每种条件下测量了50多个细胞。(B类)培养72小时后，在pH 6下测定SA-βgal活性。对于每个细胞系中的每个条件，数据表示3个单独字段的平均值，每个字段至少有50个细胞，通过未配对进行计数和比较t吨测试。误差线为±SEM。在3个独立实验中观察到类似数据。(C类)E47诱导后CEBP-α、Lamin B1和CENP-A的Western blot分析。(B类和C类)*比例尺*：62.5μm；放大200倍。(D类)通过磷酸化ERK（pERK）T202/Y204对E47诱导对ERK表达和激活的影响进行Western blot分析。pERK和ERK信号被归一化为vinculin蛋白负载控制。显示了归一化后pERK与ERK的比值。(E类)用5μm SCH772984 ERK抑制剂处理72小时后，对MIA PaCa-2/E47和PANC-1/E47细胞的全细胞提取物进行Western blot分析。(F类)在E47诱导72小时并同时用5μm SCH772984处理后，测定PANC-1/E47细胞中的SA-βgal活性。数据表示6个独立字段的平均值，每个字段至少有100个单元格，由未配对的t吨测试。误差条为±SEM。

图5
**E47介导的细胞周期阻滞需要RB。**(A类)DNA复制所需的编码E2F靶基因的转录物减少。(B类)Western blot分析表明，磷酸化RB（pSER807/811和pSER608）对E47的反应降低。(C类)Western blot分析显示BxPC-3/E47细胞中RB敲除。(D类)RB敲除和E47诱导后，用Ki67抗体对BxPC-3细胞进行免疫染色。RB敲除和E47诱导后Ki67（+）细胞数量显著增加。数据表示未配对分析的3个独立生物重复的平均值t吨测试。误差线为±SEM(E类)靶向人类RB基因的shRB-1细胞BxPC-3/E47全细胞提取物的Western blot分析B类)在MSCV启动子的控制下，用表达血凝素标记小鼠Rb的第二种病毒进行转导。(F类)E47诱导72小时后，对表达shRB-1的BxPC-3细胞进行免疫染色，shRB-1靶向人类RB和MSCV驱动的血凝素标记小鼠RB的±表达。对细胞进行Ki67免疫染色并计数。数据表示6个独立字段的平均值，每个字段至少有200个未配对的单元格进行分析t吨测试。误差线为±SEM(*G公司*)Western blot分析显示CDKN1B/p27的表达^{知识产权1}和CDKN1A/p21^CIP1级在拯救Rb表达后保持不变。**P（P）*≤ .05, ∗∗*P（P）*≤ .01, ∗∗∗*P（P）*≤ .001.

图6
**E47差异调节MYC和CDKN1B/p27的蛋白质体降解**^{知识产权1}.(A类)在所有5个细胞系中诱导E47 72小时后，MYC蛋白水平降低。(B类)72小时±他莫昔芬和6小时10μmol/L MG132治疗后全细胞提取物的Western blot。MYC和CDKN1B/p27以下的数字^{知识产权1}表示将每个谱带归一化为vinculin负载控制后（+）MG132与（-）MG132的比值。(C类)与对照载体的作用相比，BxPC-3/E47细胞中shRNA RB的敲除不影响MYC的表达。(D类)72小时±他莫昔芬和1μmol/L PD033291治疗72小时后全细胞提取物的Western blot分析。PD33291对细胞生长的影响通过处理后细胞数量的差异反映出来。使用未配对的t吨测试。误差线为3个独立生物复制品的±SEM。(E类)表达野生型（WT）MYC或T58A降解抗性MYC的慢病毒转导后PANC-1/E47细胞全细胞提取物的Western blot分析。(F类)用WT MYC或T58A MYC转导PANC-1/E47，并用三苯氧胺处理72小时以诱导E47。治疗后，用Ki67抗体对细胞进行免疫染色并计数。数据表示KI67阳性细胞的百分比。六个复制孔，每个孔至少有200个细胞，由一个未配对的t吨测试。误差线为±SEM。**P（P）*≤ .05, ∗∗∗*P（P）*≤ .001, ∗∗∗∗*P（P）*≤ .0001.

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中的注释

超越Kras：胰腺癌的MYC规则。
科克·M。科克·M。细胞分子胃肠肝素。2018年5月26日；6(2):223-224. doi:10.1016/j.jcmgh.2018.04.009。2018年eCollection。细胞分子胃肠肝素。2018 PMID：30105283 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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