Recombinant Leucine-Rich Repeat Flightless-Interacting Protein-1 Improves Healing of Acute Wounds through Its Effects on Proliferation Inflammation and Collagen Deposition

doi:10.3390/ijms19072014

.2018年7月10日；19(7):2014.

doi:10.3390/ijms19072014。

重组富含亮氨酸重复无飞物相互作用蛋白-1通过影响增殖炎症和胶原沉积促进急性创伤愈合

兹拉特科·科佩茨基¹, 娜塔莉·史蒂文斯², 金克·N·杨^三, 伊丽莎白·梅尔维尔⁴, Allison J Cowin公司⁵

附属公司

¹再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。zlatko.kopecki@unisa.edu.au。
²再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。natalie.stevens@unisa.edu.au。
^三再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。gink.yang@unisa.edu.au。
⁴再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。elizabeth.melville@unisa.edu.au。
⁵再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。allison.cowin@unisa.edu.au。

PMID： 29996558
预防性维修识别码： PMC6073877型
内政部： 10.3390/ijms19072014

重组富含亮氨酸重复无飞物相互作用蛋白-1通过影响增殖炎症和胶原沉积促进急性创伤愈合

兹拉特科·科佩基等。国际分子科学杂志. 2018.

.2018年7月10日；19(7):2014.

doi:10.3390/ijms19072014。

作者

兹拉特科·科佩基¹, 娜塔莉·史蒂文斯², 金克·N·杨^三, 伊丽莎白·梅尔维尔⁴, Allison J Cowin公司⁵

附属公司

¹再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。zlatko.kopecki@unisa.edu.au。
²再生医学，未来产业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。natalie.stevens@unisa.edu.au。
^三再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。gink.yang@unisa.edu.au。
⁴再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。elizabeth.melville@unisa.edu.au。
⁵再生医学，未来工业研究所，南澳大利亚大学，阿德莱德SA 5095，澳大利亚。allison.cowin@unisa.edu.au。

PMID： 29996558
预防性维修识别码： PMC6073877型
内政部： 10.3390/ijms19072014

摘要

伤口愈合是一个日益严重的临床问题，涉及大量的发病率、死亡率和不断上升的医疗费用。富含亮氨酸的重复无飞物相互作用蛋白-1（LRRFIP-1）调节类收费受体（TLR）介导的炎症，提示其在伤口愈合中具有潜在作用。我们试图确定LRRFIP-1在伤口修复中的作用，以及外源性添加重组LRRFIP-1（rLRRFIP-1）是否影响愈合反应。利用BALB/c小鼠全层切口急性创伤模型，我们研究了创伤对LRRFIP-1表达的影响。还研究了rLRRFIP-1对细胞增殖、炎症和胶原沉积的影响。LRRFIP-1在创伤反应中上调，被发现与无飞I（Flii）直接相关，并显著增加体内外细胞增殖。rLRRFIP-1降低体内伤口中Flii的表达，并显著改善愈合，同时抑制TLR4介导的炎症，改善胶原沉积。此外，在rLRRFIP-1治疗的伤口中观察到TGF-β1水平降低和TGF-α3水平升高，表明rLRRFIP-1可能具有抗瘢痕作用。需要进一步研究来阐明LRRFIP-1在伤口修复中的作用机制是否独立于Flii。然而，这些结果表明rLRRFIP-1可能是改善急性伤口愈合的一种治疗方式。

关键词：LRRFIP-1；胶原蛋白；不会飞的我；伤口愈合。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
富含亮氨酸的重复无飞物相互作用蛋白-1（LRRFIP-1）的表达在创伤反应中上调。(A类)对未受伤和受伤的BALB/c小鼠皮肤进行LRRFIP-1（红色）免疫组化。显示了0、3、7和14天伤口的典型图像。在每幅图像中，表皮由白色虚线描绘，e=表皮，s=结痂，w=伤口面积，d=真皮。放大倍数×20。插入×40。白色箭头=LRRFIP-1阳性细胞。比例尺=50µm；(B类)创伤后第0、3、7和14天BALB/c小鼠皮肤中皮肤LRRFIP-1蛋白表达的图示。结果表示平均值±SEM*第页< 0.05. 图为两个独立实验的代表(n个=10）；(C类)在第3天小鼠皮肤伤口上进行LRRFIP-1（红色）、角蛋白-10（绿色）、波形蛋白（绿色）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色）免疫组化。白色箭头=LRRFIP-1阳性细胞。放大倍数×60。比例尺=30µm；(天)角质细胞（HaCaTs）和成纤维细胞（HFFs）细胞裂解物由体外亚融合培养物制备，并用LRRFIP-1抗体和β-微管蛋白负荷控制进行免疫印迹。

图2
重组LRRFIP-1（rLRRFIP-2）在体外促进细胞增殖。(A类,B类)培养经rLRRFIP-1（50 ng/mL和100 ng/mL）处理的HaCats和HFF以及PBS对照，并使用WST-1分析法在24 h测定其对增殖的影响。n个= 6. 亚流入的原代小鼠角质形成细胞(C类,天)和成纤维细胞(E类,F类)用rLRRFIP-1（50 ng/mL和100 ng/mL）和PBS对照处理，并在处理后24和48 h使用增殖细胞核抗原（PCNA）（绿色）和DAPI（蓝色）的共染色分析对细胞增殖的影响。n个= 6. 放大倍数×20。比例尺=100µm。结果表示平均值±SEM*第页< 0.05.

图3
rLRRFIP-1可在体内促进伤口愈合和细胞增殖。在野生型（WT）小鼠的背部皮肤上做了两个1厘米厚的切口。第0天在伤口边缘进行rLRRFIP-1皮内注射（1和10µg/mL）和PBS对照(n个= 10). 伤后第7天收获伤口。(A类,B类)创伤后第0天和第7天伤口面积和伤口间隙宏观分析的图形表示；(C类)经rLRRFIP-1（1µg/mL和10µg/mL）和PBS对照治疗的小鼠伤口的代表性苏木精和曙红染色7天伤口切片显示了伤口愈合结果的差异。黑色箭头突出了不同治疗组之间伤口间隙的差异；(天,E类)创伤后第7天的伤口区域和伤口间隙的显微镜分析的图示；(F类)通过测量创伤后第3天、第7天和第14天表皮覆盖的伤口百分比来评估伤口再上皮化。*a=rLRRFIP-1（1µg/mL）vs.PBS；*b=rLRRFIP-1（10µg/mL）vs.PBS。结果代表平均值±SEM。n个= 10; (**G公司**,**H（H）**)用rLRRFIP-1（1或10µg/mL）或PBS对照治疗的再上皮化第3天和第7天野生型伤口的表皮舌中PCNA阳性表皮细胞（白色荧光）的代表性图像，以及新表皮中计数的PCNA阳性细胞的图形表示，以细胞密度/面积表示。红色虚线代表真皮-表皮交界处。e=表皮，w=伤口。放大倍数×20。比例尺=20µm。结果表示平均值±SEM*第页< 0.05. 图为两个独立实验的代表(n个=10）。

图4
LRRFIP-1与无飞行物I（Flii）直接相关，并降低其在体内伤口中的水平。(A类)从融合的HaCaT和HFF中制备抗-LRRFIP-1和抗Flii免疫沉淀物（IP），并分别用Flii和LRRFIP-1抗体进行免疫印迹。(B类,C类)伤后第7天，LRRFIP-1处理（1µg/mL）野生型（WT）小鼠伤口中Flii表达的代表性图像和图形分析（白色荧光）。在每幅图像中，表皮由白色虚线描绘，e表示表皮，d表示受伤的真皮区域。放大倍数×20。比例尺=50µm*第页< 0.05. 图为两个独立实验的代表(n个= 10).

图5
rLRRFIP-1治疗可调节toll样受体4（TLR4）信号传导并减少体内皮肤伤口炎症。(A类)愈合后第7天，rLRRFIP-1（1µg/mL）或PBS对照治疗伤口中TLR4、NIMP-R14和F4/80阳性真皮细胞（绿色荧光）的代表性图像，说明rLRRFIP-1治疗后炎症反应降低。表皮由白色虚线描绘，e表示表皮，w表示伤口，白色箭头表示阳性染色细胞。放大倍数×20。比例尺=50µm适用于所有图像；(B类)对rLRRFIP-1或PBS治疗动物伤口中TLR4信号和NIMP-R14和F4/80阳性皮肤细胞的图形分析。结果表示平均值±SEM*第页< 0.05. ns=不显著。n个= 10.

图6
rLRRFIP-1治疗影响体内创面TGF-β水平和早期胶原沉积。(A类,B类)用rLRRFIP-1（1µg/mL）或PBS对照治疗的第3天和第7天伤口中TGF-β1和TGF-α3水平（白色荧光）的代表性图像和图形分析表明，在rLRRFIP-1治疗后，体内伤口中TGFβ1水平降低，TGFβ3水平升高。表皮由白色虚线描绘，e表示表皮，w表示伤口真皮。放大倍数×20。比例尺=50µm；(C类,天)使用rLRRFIP-1（1µg/mL）或PBS对照治疗后第7天体内伤口的总胶原蛋白水平的代表性图像和图形分析，说明使用rLRRIP-1（1μg/mL）治疗后伤口（绿色）中总胶原蛋白沉积增加。放大倍数×10。比例尺=100µm。结果表示平均值±SEM*第页< 0.05.n个= 10.

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