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.2018年7月9日；34（1）:56-68.e9。
doi:10.1016/j.cell.2018.05.014。

CDKN2A双等位基因缺失通过BRN2激活引发黑色素瘤侵袭

曾汉林（Hanlin Zeng） 1, 阿帕娜·乔拉普尔 1, 猎人沙恩 2, 乌苏拉·E·朗 2, 罗德里戈·托雷斯 1, 张云田 1, 安德鲁·麦克尼尔 1, 托马斯·波顿 2, 觉林 三, 马修·多恩 4, 英格玛N巴斯蒂安 2, 理查德余 5, 杰弗里·P·诺斯 6, 劳拉·平卡斯 6, 贝斯·鲁本 7, 南希·M·约瑟夫 8, Iwei Yeh公司 2, 鲍里斯·巴斯蒂安 2, 罗伯特·L·贾德森 9
附属公司

CDKN2A的双等位基因缺失通过BRN2激活引发黑色素瘤侵袭

曾汉林（Hanlin Zeng）等。 癌细胞. .

摘要

CDKN2A抑癌基因的缺失与黑色素瘤转移有关，但连接这些现象的机制尚不清楚。利用CRISPR-Cas9构建一个从原代人黑素细胞启动的黑色素瘤细胞模型，我们发现一种谱系限制性转录因子BRN2位于CDKN2A下游，并由E2F1直接调控。在一组具有不同进展阶段的黑素细胞肿瘤中，我们观察到CDKN2A缺失与侵袭行为的发生和BRN2表达的增加相一致。CDKN2A蛋白产物p16的丢失INK4A（墨水）允许人类黑色素瘤细胞系在小鼠中的转移扩散，这是通过抑制BRN2而挽救的表型。这些结果证明了CDKN2A通过抑制BRN2抑制黑色素瘤侵袭的启动的机制。

关键词：BRN2；CDKN2A；CRISPR工程；E2F1；入侵；黑素细胞；黑色素瘤。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明：B.C.B.曾担任礼来公司的顾问。

数字

图1
图1。工程CDKN2A型黑素细胞缺失
（A） 引入CMV-EGFP局部敲除替代CMV-EGF基因外显子2的策略CDKN2A型（B）编辑后三周EGFP阳性NHM的百分比CDKN2A型轨迹。数据表示平均值，25第个和75第个三种NHM制剂的八个CRISPR反应的百分位数、最小值和最大值。（C） 隔离策略CDKN2A型null NHM用于与野生型同胞细胞进行比较。直接转染后，两种Cas9−和案例9+条件含有EGFP+单元格（顶部）。随时间推移，案例9−细胞变得均匀EGFP−和其余EGFP+Cas9中的细胞+种群是孤立的（中间）。分离的细胞是稳定的EGFP+并与匹配的EGFP-细胞进行比较（底部）。（D） 两者的Western blot检测CDKN2A型蛋白质产品（p16INK4A（墨水）和第14页农业研究基金，左）和CDKN2B型蛋白质产物（p15INK4B（墨水4B），右）在隔离EGFP中+和EGFP−NHM人口。（E） p16的免疫荧光显示INK4A（墨水）EGFP中的表达+和匹配的EGFP−NHM。（F） 三个EGFP克隆的靶向测序+监测非目标Cas9切割的种群。图中显示了基因间、编码区和内含子区中缺失（Del）和点突变（PM）的突变等位基因频率。NHM1-3是指独立的原发性黑素细胞衍生物和工程事件。另请参见图S1。
图2
图2。CDKN2A型缺失促进黑素细胞运动和侵袭
（A） 实验装置示意图。对于每个实验，NHM都是从捐赠的组织中提取出来的，并为CDKN2A型损失如图1所示。隔离后，CDKN2A型通过数字全息细胞术监测空白和野生型同胞细胞72小时。对细胞分裂率、运动性、形态、生长停滞和脱落进行量化。代表性的全息相移图像（左下角）显示了彩色彗尾跟踪细胞。（B） 单细胞运动分析CDKN2A型与野生型兄弟姐妹相比，NHM为空。方框图和胡须图表示平均值，10第个, 25第个,75第个和90第个来自三种NHM制剂的三种CRISPR反应的至少五十个细胞的百分位数。（C） 定量如（B）所示，但不包括在24小时分析前后72小时内分裂的细胞。（D和E）迁移到划痕区域的NHM的时变全息相移图像（D）和量化（E）。黄线表示第一个时间点的划痕限制。误差条表示NHM三种制剂的三个CRISPR反应平均值的标准偏差。（F） 跨井侵入分析的量化，其中CDKN2A型零NHM和野生型同胞需要通过高密度基底膜提取物迁移。方框图和胡须图表示平均值，25第个和75第个三种NHM制剂的五个CRISPR反应的百分位数、最小值和最大值。（G） 单细胞运动分析CDKN2A型用所示向量转换并排序的空NHM。方框图和胡须图表示平均值，10第个, 25第个, 75第个和90第个来自三种转导物的至少50个细胞的百分位数。星号表示未配对t检验的p值*<0.05至*****<0.000005。N.S.表示无显著差异。另请参见图S2。
图3
图3。第16页INK4A（墨水）独立于驾驶员突变调节运动性
（A） 引入BRAF的策略V600E版本点突变。HDR模板中心显示（蓝色），点突变导致预期密码子改变（橙色）或沉默突变破坏sgRNA结合（绿色）突出显示。sgRNA序列显示为紫色。（B） BRAF的Western blot检测V600E型和第16页墨迹4a工程NHM中ERK的表达和磷酸化。（C） 基因工程NHM的群体运动分析BRAF公司V600E型和/或CDKN2A型删除。误差线表示三个实验平均值的标准偏差。（D） 十个不同遗传背景的黑色素瘤细胞系的运动性比较。通过激活驱动突变（BRAF、NRAS、CKIT或野生型）和CDKN2A型状态。CDKN2A型状态被指定为野生型和表达型（野生型）、单等位基因突变和表达型、双等位基因断裂（纯合子）或野生型和沉默型（沉默型）。方框图和胡须图表示平均值，10第个, 25第个, 75第个和90第个每行40个细胞的百分位数。（E） EF1a驱动的p16的作用INK4A（墨水）运动性表达CDKN2A型无效或沉默的黑色素瘤线（左）。shRNA介导的p16的作用INK4A（墨水）p16中运动性的敲除INK4A（墨水）表达黑色素瘤细胞系（右）。误差条表示每种条件下40个单元格平均值的标准偏差。（F） p16的作用比较墨迹4a10株黑色素瘤细胞增殖和运动能力下降。红点表示shRNA-介导的p16的比较INK4A（墨水）p16中归一化为矢量控制的敲除INK4A（墨水）表达黑色素瘤细胞系。绿点表示标准化为EF1a驱动的p16的矢量控制的比较INK4A（墨水）中的表达式CDKN2A型空行或静默行。增殖和运动之间没有观察到明显的相关性。星号表示未配对t检验的**<0.005至***<0.00005的p值。N.S.表示无显著差异。另请参见图S3。
图4
图4。第16页INK4A（墨水）缺失诱导WM793黑色素瘤细胞转移
（A） 由已确定的癌症基因组成的500个基因组被用于对WM793和1205Lu细胞系进行测序。如图所示，点突变由每个细胞系中的突变等位基因频率（MAF）分层。可能的致病性突变以红色突出显示。沿对角线的数据点表示细胞系之间共享的突变，而沿任一轴的数据点则表示私有突变。（B） 根据测序深度推断WM793和1205Lu细胞系之间的拷贝数变化（顶部）。局部杂合（左下，WM793）和纯合（右下，1205Lu）缺失影响CDKN2A型以红色突出显示。（C）原始WM793和衍生转移性1205Lu细胞系之间遗传关系的系统发生树表示。（D） 转移检测的实验装置示意图。用pSICOR-mCherry或pSICOR-shp16转导的WM793细胞INK4A（墨水）-用pHIV-zsGreen或pHIV-p16转导的mCherry或1205Lu细胞INK4A（墨水）-对IRES-zsGreen进行荧光蛋白表达分类，并将其皮下注射到NSG小鼠中（每种情况5只）。监测原发肿瘤体积，五周后分析肺转移情况。典型的H&E染色肺切片显示转移病灶（右）。红色刻度条=100µm。（E） 人核抗原（HNA）免疫荧光染色的代表性肺切片。红色刻度条=100µm。（F） 定量（E）的IF图像，显示每种情况下肺部HNA阳性细胞的数量（每组代表5只小鼠的100个定量切片）。方框图和胡须图表示平均值，10第个, 25第个, 75第个& 90第个百分位数。（G） 使用人（顶部）或小鼠（底部）特异性引物对来自小鼠肺的基因组DNA进行PCR扩增，以检测微转移。对所有叶进行了测试，并显示了一个具有代表性的实验。（H） 通过实验对小鼠肺中人类特异性DNA进行量化。数值是通过定量PCR测量的每个样本的人类DNA绝对浓度。数据表示每种情况下5只小鼠20个肺叶的活检。水平条表示平均值。（一） 所有小鼠的原发肿瘤体积。误差条表示平均值的标准偏差。星号表示未配对t检验的p值**<0.005和***<0.00005。N.S.表示无显著差异。另请参见图S4。
图5
图5。CDKN2A型缺失诱导BRN2转录激活
（A） 比较三对独立衍生的CDKN2A型空NHM和匹配的野生型兄弟单元格。q值<0.05和log2倍变化>1.7的差异表达转录物以浅绿色突出显示。BRN2转录物以红色突出显示。（B）比较BRN2、RB1、磷酸化RB1、CDK4和p16的蛋白质印迹INK4A（墨水）三个独立派生集的表达式CDKN2A型零工程NHM和野生型同胞细胞。（C） 的运动性CDKN2A型转染siBRN2（顶部）和BRN2敲除的代表性western blot验证（底部）后，NHMs无效。对三种NHM制剂的三种CRISPR反应中的至少50个细胞进行了量化。（D） 在（C）中分析了转染后三天相对于转染后一天的细胞总数。误差线表示平均值的标准偏差。（E） 1205Lu黑色素瘤细胞转染siBRN2后的运动性（上图）和BRN2敲除的代表性western blot验证（下图）。（F） 对表达pLKO.1-shControl或pLKO-1-shBRN2的1205Lu细胞和BRN2敲除的代表性western blot验证（下图）进行小鼠肺中人类特异性DNA的定量比较。数值是每个样本的人类DNA绝对浓度。数据表示每种情况下对5只小鼠的25个肺叶进行的活检。所有箱形和须状图表示平均值，10第个, 25第个, 75第个& 90第个百分位数。星号表示未配对t检验的p值**<0.005和***<0.0005。N.S.表示无显著差异。
图6
图6。CDKN2A型/第16页INK4A（墨水）损失与侵袭性黑色素瘤和BRN2增加有关
（A） 单等位基因或双等位基因痣或黑色素瘤的比例CDKN2A型中断。黑色素瘤分为原位黑色素瘤（MIS）、薄型侵袭性黑色素癌（T1期）、厚型侵袭性黑素瘤（T2+期）和远端转移性黑素癌（来自TCGA公共数据库）。（B） 痣（n=12）和黑色素瘤（n=19）区域BRN2 mRNA水平的比较。方框图和胡须图表示平均值，25第个和75第个百分位数、最小值和最大值。（C） 下一代显微解剖过渡病例测序中p16INK4A和BRN2 mRNA的表达。至少一个等位基因包含局部缺失或点突变，仅影响CDKN2A型基因用标签（#）指定。（D） 典型的过渡病变，其中MIS前体和侵袭性成分可区分。双p16INK4A（墨水）显示了（棕色）和黑素细胞标记物MelanA（粉红色）免疫组织化学（顶部）和H&E染色（底部）。（E和F）所示为H&E、MelanA/p16染色的连续切片INK4A（墨水）来自痣（E）代表性MIS和来自MIS（F）区域的黑色素瘤的MelanA/Ki67和BRN2。虚线表示MIS（黄色）、痣（蓝色）和侵袭性黑色素瘤（绿色）区域的边界。黄色箭头突出显示MelanA和p16INK4A（墨水）MIS区域阳性细胞。（G） IHC显示蛋白染色阳性的痣、MIS和黑色素瘤病例百分比的量化。另请参见图S5。
图7
图7。第16页INK4A（墨水）缺失转录通过E2F1介导的途径激活BRN2
（A） 三种基因集富集分析CDKN2A型零NHM线与三条相比CDKN2A型野生型NHM线路（工程NHM）或CDKN2A型野生型区域与CDKN2A型临床队列的无效区域（过渡病例队列）。#表示富集分数<0.0005的NOM p值和FDR q值。（B） 控制萤火虫荧光素酶的表达POU3F2启动子归一化为组成性表达的肾小球荧光素酶CDKN2A型空白NHM（n=10）和野生型同胞细胞（n=6）经PBS或指示浓度的CDK4/6抑制剂PD 0332991处理24小时。方框图和晶须图表示平均值，25第个和75第个百分位数、最小值和最大值。（C） RT-qPCR定量分析BRN2 mRNA水平CDKN2A型空白NHMs（n=9）和野生型同胞细胞（n=6）经PBS和CDK4/6抑制剂处理24小时。方框图和晶须图表示平均值，25第个和75第个百分位数、最小值和最大值。（D） 控制萤火虫荧光素酶的表达POU3F2启动子归一化为组成性表达的肾小球荧光素酶CDKN2A型空白NHM和野生型同胞细胞转染对照siRNA（siCon）或E2F1 siRNA。方框图和胡须图表示平均值，25第个和75第个11个实验的百分位数、最小值和最大值。（E） 运动性（顶部）和蛋白质印迹验证（底部）CDKN2A型用PBS或10µM CDK4/6抑制剂PD 0332991处理24小时后，NHMs无效。对三种NHMs制剂的三个CRISPR反应中的至少50个细胞进行量化。方框图和胡须图表示平均值，10第个, 25第个, 75第个& 90第个百分位数。（F） 的动机（顶部）和蛋白质印迹验证（底部）CDKN2A型转染siE2F1后NHM为空。对三种NHM制剂的三种CRISPR反应中的至少50个细胞进行了量化。方框图和胡须图表示平均值，10第个, 25第个, 75第个& 90第个百分位数。（G） BRN2转录起始位点（TSS，红色）和0-500bp上游序列示意图。指出了用于ChIP实验（蓝色水平线）和预测E2F1结合位点（橙色垂直线）的PCR产物的设计。（H） 对E2F1结合的ChIP-qPCR检测POU3F2启动子区。由抗E2F1或抗IgG抗体沉淀的（G）中所示引物集的相对扩增绘制为输入的百分比。误差线表示四个实验平均值的标准偏差。（I） 侵袭性黑色素瘤组织中p-RB1和BRN2的共免疫荧光显像的代表性图像。（J） 如（I）所示染色的八例患者的核p-RB1强度的单细胞定量。细胞分层为BRN2阳性（n=103）或阴性（n=3877）。方框图和胡须图表示平均值，25第个和75第个百分位数、最小值和最大值。星号表示未配对t检验（面板B–H）或Mann-Whitney检验（面板J）的p值*<0.05至***<0.00005，另见图S6。
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中的注释

  • BRN 2入侵。
    Pathria G，Ronai ZA公司。 Pathria G等人。 癌细胞。2018年7月9日；34(1):1-3. doi:10.1016/j.cell.2018.06.010。 癌细胞。2018 PMID：29990495 免费PMC文章。

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