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.2018年6月8日；14(9):1067-1080.
doi:10.7150/ijbs.23845。 2018年eCollection。

WDR1通过ADF/cofilin介导的肌动蛋白动力学促进细胞生长和迁移并参与非小细胞肺癌的恶性表型

白银苑 1, 张瑞瑞 1, 胡季生 1, 刘忠英 1, 朝阳 1, 张同村 1, 张晨曦 2
附属公司

WDR1通过ADF/cofilin介导的肌动蛋白动力学促进细胞生长和迁移并参与非小细胞肺癌的恶性表型

白银苑等。 国际生物科学杂志. .

摘要

肿瘤的特点是细胞迁移和侵袭，这涉及到强烈的肌动蛋白动力学。肌动蛋白动力学的调节与癌细胞迁移和肿瘤进展有关。WDR1（WD-repeat domain 1）是肌动蛋白解聚因子（ADF）/cofilin的主要辅因子，强烈促进ADF/cofilin-介导的肌动蛋白的分解。WDR1在非小细胞肺癌（NSCLC）进展中的作用尚不清楚。在这里，我们发现WDR1在人类非小细胞肺癌组织中的表达水平与相邻的非肿瘤组织相比有所增加，并且WDR1的高水平与非小细胞肝癌患者的不良预后相关。敲除NSCLC细胞中WDR1显著抑制细胞迁移、侵袭、EMT过程和肿瘤细胞生长在体外和体内否则，WDR1的过度表达会促进NSCLC细胞的增殖和迁移。从机制上讲，我们的数据表明WDR1可能通过肌动蛋白细胞骨架介导的YAP调控肿瘤细胞的增殖和迁移，并且我们证明WDR1通过ADF/cofilin介导的肌动蛋白分解促进NSCLC的进展。我们的研究结果表明，ADF/cofilin-WDR1-actin轴作为恶性表型的激活剂，将成为肺癌有希望的治疗靶点。

关键词：ADF/cofilin；肌动蛋白动力学；癌症；非小细胞肺癌；WDR1中。

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利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
WDR1上调，与非小细胞肺癌患者预后不良相关。答：用qPCR方法检测非小细胞肺癌组织及其匹配的邻近非肿瘤组织中WDR1的mRNA水平。与邻近的非肿瘤组织相比，WDR1在非小细胞肺癌组织中的表达水平增加。B类：Kaplan-Meier图显示了所有病史的非小细胞肺癌患者的总体生存率，并按WDR1的高表达或低表达进行了分层。WDR1高表达水平与总生存率降低相关。数据表示为平均值±SEM。***P<0.001。
图2
图2
WDR1促进NSCLC增长在体外.A： 在A549、H1299和H226细胞系中，我们分别产生了稳定的WDR1敲除（由shRNA介导）和过度表达细胞。通过蛋白质印迹分析检测WDR1敲低和过表达的效率。结果表明，shWDR1显著下调WDR1的表达水平；与转染PCDH-GFP质粒的细胞（对照组）相比，转染了PCDH-WDR1质粒（WDR1）的细胞WDR1增加。对相对蛋白质水平进行了量化，结果显示在相应的条带下方。B类：CCK-8分析显示，WDR1敲除显著抑制A549和H1299细胞的增殖率。抄送：H226细胞CCK-8检测。与相应的对照组相比，WDR1敲除显著抑制增殖率，而WDR1过度表达促进增殖率。医生：通过克隆形成实验测定A549细胞的克隆能力。与shCTL细胞相比，shWDR1细胞的集落形成受到显著抑制。电子-传真：蛋白质印迹分析(E类)和量化(F类)A549细胞中细胞周期调节因子的蛋白质水平。与shCTL相比，shWDR1细胞中的细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期素D1、细胞周期因子E、Cdk1减少，p27显著增加。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
图3
图3
WDR1积极调节细胞迁移、侵袭并诱导EMT过程在体外.答：A549、H1299和H226细胞系的伤口愈合试验。与对照细胞（shCTL）相比，敲除WDR1（shWDR1）显著抑制A549、H1299和H226细胞的细胞迁移（48h）。B类：创伤愈合试验和定量分析表明，WDR1（WDR1）的过度表达增加了A549、H1299和H226细胞系相对于对照细胞（GFP）的细胞迁移（36小时）。抄送：Matrigel侵袭实验和定量分析表明，WDR1缺失可显著抑制H1299和A549细胞的侵袭能力。D-电子：蛋白质印迹分析(D类)和量化(E类)结果显示，shWDR1细胞中N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表达水平降低，E-cadherin的表达水平升高。蜗牛和扭曲在shWDR1.细胞中减少但不显著。靶蛋白带用箭头表示。传真：A549细胞E-cadherin和N-cadherin的免疫荧光染色分析。shWDR1细胞中的N-cadherin染色显著减少，而E-cadherin的染色增加，有时呈点状（箭头所示）。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。比例尺=20μm。
图4
图4
WDR1促进肿瘤生长并诱导EMT过程体内.答：裸鼠异种移植模型。用干扰shRNA（shCTL）或抗WDR1（shWDR1）和2*10的shRNA转染A549细胞6将细胞注射到雄性裸鼠体内。B类：结节取自shCTL组和shWDR1组。shWDR1细胞衍生的肿瘤结节明显小于shCTL组。抄送：肿瘤生长曲线。每隔10天测量肿瘤的长度和宽度。医生：显示shCTL和shWDR1组的肿瘤重量。电子邮箱：shCTL和shWDR1组肿瘤中Ki67免疫组化染色和Ki67阳性细胞数量的定量。F-G：通过western blotting分析检测shCTL和shWDR1细胞来源肿瘤中提取的蛋白中的EMT相关蛋白。Western blotting分析和定量显示，与shCTL细胞相比，shWDR1细胞来源的肿瘤中N-cadherin表达水平降低，E-cadherin水平升高。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
图5
图5
WDR1可能通过肌动蛋白细胞骨架调节YAP活性促进肿瘤细胞增殖和迁移。答：western blotting分析检测总YAP和p-YAP蛋白水平。Western blotting和定量数据表明，第1周消耗导致总YAP水平显著降低，pYAP（S127）和pYAP水平增加（S381）（a，B），而第1周过表达增加了总的YAP，降低了pYAP（S127）、pYAP的（S381）（C，D）。电子邮箱：所示蛋白质的免疫印迹。将细胞裂解物分为细胞核和细胞质部分。TBP和GAPDH显示为每个分馏的负荷控制。shWDR1细胞的核YAP和细胞质YAP水平显著降低。还显示了相对蛋白质水平的定量。传真：YAP靶基因CTGF、ANKRD1和CYR61相对标准化表达的qPCR分析。三个靶基因在shWDR1 A549细胞中的表达水平显著降低。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
图6
图6
WDR1缺失会导致细胞形态破坏、F-actin积累、actin和total-cofilin水平增加。答：A549细胞的显微镜分析。与shCTL细胞相比，大多数shWDR1细胞的细胞变小，细胞形状变圆。B类：ImageJ计算的A549细胞横截面积，与CTL相比，shWDR1细胞的横截面积明显更小。抄送：在shWDR1细胞中，通过ImageJ测量的细胞长度/宽度比率显著降低。医生：A549细胞中阴茎倍体蛋白和总纤维素酶的免疫荧光染色。在shWDR1细胞中，在收缩的突起中观察到F-actin的积累，并且在F-actin积累的地方，总蛋白丰富（箭头所示）。电子邮箱：对具有收缩突起的A549细胞的数量进行定量。与shCTL相比，shWDR1细胞中具有收缩突起的细胞比例显著增加。传真：在A549和H1299细胞中，western blotting分析显示shWDR1细胞中的pan-actin和total-cofilin水平增加。靶蛋白带用箭头表示。数据表示为平均值±SEM。***P<0.001。比例尺=10μm。
图7
图7
cofilin的过度表达可挽救WDR1敲除细胞中F-actin积累的表型、缩小突起以及受损的细胞迁移和侵袭。答：用pCDNA-Flag-cofilin质粒转染shWDR1处理的A549细胞，通过western blotting检测Flag-cofilin的转染效率。cofilin的强制过表达降低了WDR1敲除诱导的肌动蛋白水平的增加。还显示了相应对照的相关蛋白的定量。B类：使用Flag的抗体对F-肌动蛋白和Flag辅因子进行双重免疫染色。shWDR1细胞中Flag-cofilin的过度表达挽救了F-actin积累和细胞形态破坏的表型。首席执行官：基质侵入试验(C类)和伤口愈合试验(D类)在A549和H1299细胞中。强制过表达cofilin后，细胞迁移率和侵袭能力部分恢复。数据表示为平均值±SEM。**P<0.01，***P<0.001。比例尺=10μm。
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