A Novel Oncolytic Chimeric Orthopoxvirus Encoding Luciferase Enables Real-Time View of Colorectal Cancer Cell Infection

doi:10.1016/j.omto.2018.03.001

.2018年3月22日9:13-21。

doi:10.1016/j.omto.2018.03.001。 eCollection 2018年6月29日。

一种编码荧光素酶的新型溶瘤嵌合正痘病毒可实时观察结直肠癌细胞感染

附属公司

¹美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望城国家医疗中心肿瘤外科外科。
²基因治疗中心，血液学和造血细胞移植部，贝克曼研究所，希望之城国家医疗中心，杜阿尔特，CA 91010，美国。
^三基因编辑和病毒载体核心，贝克曼研究所，希望之城国家医疗中心，杜阿尔特，加利福尼亚州91010，美国。

PMID： 29988502
预防性维修识别码： PMC6026443型
内政部： 2016年10月10日/j.omto.2018.03.001

一种编码萤光素酶的新型溶瘤嵌合正痘病毒能够实时观察结直肠癌细胞感染

迈克尔·奥利里等。 Mol-Ther Oncolytics公司. 2018.

.2018年3月22日9:13-21。

doi:10.1016/j.omto.2018.03.001。 eCollection 2018年6月29日。

附属公司

¹美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望城国家医疗中心肿瘤外科外科。
²基因治疗中心，血液学和造血细胞移植系，贝克曼研究所，希望之城国家医疗中心，杜阿尔特，CA 91010，美国。
^三基因编辑和病毒载体核心，贝克曼研究所，希望之城国家医疗中心，杜阿尔特，加利福尼亚州91010，美国。

PMID： 29988502
预防性维修识别码： PMC6026443型
内政部： 2016年10月10日/j.omto.2018.03.001

摘要

本研究假设一种新型溶瘤嵌合正痘病毒CF33-Fluc可成像并以结直肠癌细胞（CRC）为靶点。构建了一种新型嵌合正痘病毒（CF33）。将胸苷激酶基因座替换为萤火虫荧光素酶（Fluc），以产生重组病毒CF33-Fluc。体外进行细胞毒性和病毒复制测定。体内CRC侧翼异种移植物接受单剂量肿瘤内或静脉注射CF33-Fluc。通过荧光素酶成像和器官滴度分析病毒的生物分布。CF33-Fluc感染、复制并杀死CRC在体外以剂量依赖的方式。与除一个亲本菌株外的所有菌株相比，CF33具有更好的细胞外包膜病毒分泌能力。肿瘤迅速消退或稳定体内无论HCT-116大肠肿瘤异种移植模型中的病毒传递方法如何，在短时间内以低剂量给药。病毒感染肿瘤细胞中荧光素酶的快速表达与治疗反应相关。CRC死亡通过坏死途径发生。CF33-Fluc在结肠癌细胞中复制并杀死结肠癌细胞在体外和体内无论交付方式如何。荧光素酶的表达能够实时跟踪病毒复制。尽管存在嵌合现象，但CRC死亡是通过标准痘病毒诱导机制发生的。免疫活性模型需要进一步研究。

关键词：细胞外包膜病毒；基因表达；溶瘤病毒；系统治疗；病毒治疗。

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数字

图1
CF-33具有优于父母菌株的复制能力，对结肠癌细胞具有强烈的细胞毒性*体外试验*父母病毒株和CF-33感染的HCT116细胞呈剂量依赖性。（A）在感染后12和18小时，从上清液中测量外包膜病毒（EEV）的分泌形式。（B）在24、48和72小时测量感染HCT116细胞的裂解物。通过标准菌斑分析测定病毒滴度。（C） CF-33以剂量依赖的方式杀死结肠癌细胞HCT-116、SW620和LoVo。误差条表示标准偏差。在每个时间点使用普通单向方差分析*p<0.05**p<0.01***p<0.001。与感染前0小时未感染细胞的滴度相比，PFU/细胞的倍数变化。

图2
病毒编码荧光素酶活性呈剂量依赖性*体外试验*（A） HCT116细胞在指定的MOI中以6孔板格式感染CF33-Fluc病毒。用Lago-X成像系统对感染后24小时的细胞进行生物发光成像。（B）如（A）所示感染细胞，并在感染后24小时收集细胞裂解物。使用荧光素酶测定试剂盒以相对光度计单位（RLU）测量总荧光素酶活性。荧光素酶的差异表达在外周似乎更强，这归因于被镀细胞的汇合，而这些细胞在微孔的下周更为密集。此外，较低MOI的中心荧光素酶表达缺失可能是由于24小时内感染性水平降低，而MOI为3时中心荧光素酶表达缺失则归因于细胞死亡。误差条指示SD。

图3
病毒诱导的细胞死亡通过坏死途径发生（A）病毒感染的荧光显微镜显示TUNEL分析对照显示荧光绿色DNA损伤指示凋亡，而未感染细胞和高剂量MOI为5的高感染细胞均未显示DNA损伤的证据。（B）感染后18小时，对膜联蛋白和磷脂酰肌醇（PI）进行FACS分析，检测未感染细胞（左）和感染细胞（右）。这表明，虽然存在许多死亡细胞（PI表示），但没有一个细胞因病毒感染（膜联蛋白）而发生凋亡。（C）在48和72小时时，感染细胞的ATP含量明显低于未感染对照组。错误条表示SD。使用了学生t测试。***表示48小时和72小时时间点的统计显著性定义为p<001。（D）通过流式细胞术分析有无病毒感染的钙网蛋白，显示感染细胞中钙网蛋白增加。（E）上清液中的ATP分泌在感染细胞中被证明至少高出1.5倍（误差线表示SD）。（F）感染细胞上清液中HMGB1蛋白的分泌在感染细胞和非感染细胞中显著增加。

图4
CF33-Fluc生物发光与肿瘤病毒滴度对应（A）代表性小鼠接受了CF33-Fulc瘤内注射（IT）。生物发光与病毒滴度和肿瘤消退相一致。（B）静脉注射（IV）组在感兴趣区域（ROI）的平均生物发光强度需要更长时间才能达到，但具有与病毒复制相关的持续反应。（C）感染后10天，静脉注射与IT肿瘤和器官滴度相似。（D）在感染后50天，IV组的肿瘤病毒滴度延长，而IT组的滴度降低，这与肿瘤退化相对应，从而降低了病毒活性。误差条指示SD。

图5
肿瘤内或静脉注射后病毒在肿瘤内传播，并对感染和非感染小鼠的重要器官进行检查（A）。虽然IV组的感染模式更具浸润性，但IT组的病毒感染优势更为一致，可能表明疗效是溶瘤能力和有效病毒传递的直接作用。（B）大脑、肾脏、肝脏和脾脏的代表性幻灯片显示，基于病毒感染的组织病理学器官外观没有差异。

图6
CF33 Fluc在HCT116异种移植模型中显示出肿瘤内和静脉给药后的抗肿瘤活性——IV（B）（8只小鼠/组，第10天处死4只）和IT（A）（5只小鼠/组，第10天处死2只）与对照组（静脉注射PBS对照组有四只小鼠，IT对照组有两只小鼠）相比，给药方法可消除肿瘤生长。IT和IV治疗组都有单独的病理肿瘤完全消退的小鼠*IT p=0.037*静脉注射p=0.034。

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