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.2018年7月9日；9(1):2658.
doi:10.1038/s41467-018-05077-9。

含DNA的细胞外囊泡通过抗原驱动接触激活T细胞启动树突状细胞

丹尼尔·托拉尔巴 1 2, Francesc Baixauli 1 三, 卡罗琳娜·维拉罗亚·贝尔特里 1 2, 艾琳·费尔南德斯·德尔加多 1 2, 安娜·拉托雷·佩利瑟 4, 丽贝卡·阿西恩·佩雷斯 5, 诺亚·巴丁·科弗雷斯 1 2 6, 天使路易斯·贾索·塔马梅 7, 萨尔瓦多-伊波拉 5, 英马特拉达·豪尔赫 6 8, Gloria González-Aseguinolaza公司 9, 约翰·加劳德 5, 米格尔·文森特·曼扎内莱斯 10, 何塞·安东尼奥·恩里克斯 5 11, 玛丽亚·米特布伦 12 13, 弗朗西斯科·桑切斯-马德里 14 15 16
附属机构

含DNA的细胞外囊泡通过抗原驱动接触激活T细胞启动树突状细胞

丹尼尔·托拉尔巴等。 国家公社. .

摘要

T细胞与携带抗原的树突状细胞（DC）的相互作用导致T细胞活化，但这种相互作用是否对DC功能产生生理影响在很大程度上尚未探索。这里我们表明，当携带抗原的DC接触T细胞时，DC启动抗致病程序。这种相互作用的信号通过含有基因组和线粒体DNA的细胞外囊泡（EV）从T细胞传递到DC，以通过cGAS/STING细胞溶质DNA感应途径和IRF3依赖性干扰素调节基因的表达诱导抗病毒反应。此外，经EV治疗的DC对随后的病毒感染具有更强的抵抗力。总之，我们的结果表明，T细胞通过外体DNA的转移启动DC，支持抗原依赖性接触在保护DC免受病原体感染方面的特殊作用。先天性免疫细胞和适应性免疫细胞之间的相互交流使得对未知威胁作出有效反应。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
外显子穿梭线粒体蛋白质。一用于从细胞培养上清液中分离和纯化外泌体的差速超速离心方案。b通过纳米粒子追踪分析（NTA）对原始人类T淋巴细胞纯化EV的大小分布进行分析。c（c）T细胞EV中肽的基因本体（GO）细胞成分分析。d日对用佛波酯-肉豆蔻酸盐（PMA）和离子霉素处理或不处理的人原代T淋巴细胞培养上清中获得的EV线粒体蛋白进行Western blot分析。对细胞和EV进行线粒体DNA相关蛋白（TFAM和ATAD3）、线粒体内膜（COX1和细胞色素C）、线粒体外膜（VDAC1）、线粒体基质（线粒体锰超氧化物歧化酶，MnSOD）以及外体标记物TSG101和CD81的印迹。e（电子）蔗糖级分中ATAD3、TFAM和外来体标记物CD81和TSG101的蛋白质印迹分析。将从人T淋巴细胞培养上清中获得的EV放置在不连续的蔗糖梯度上，并通过过夜离心使其漂浮。收集梯度组分并通过免疫印迹分析，以揭示mtDNA结合蛋白和外体蛋白在蔗糖组分中的分布，从低到高蔗糖密度（从左到右）。所示凝胶在三个独立实验中具有代表性
图2
图2
T细胞外体穿梭线粒体DNA和基因组DNA。一与从人类原代T细胞分离的EV（EV）和线粒体提取物（mtDNA）中的线粒体基因组一致的序列读取数的表示。b上面板：线粒体基因组图，显示PCR分析的线粒体DNA区域（标记为红色：HVRII、tRNALeu、COXII和16 S rRNA）。下部面板：显示不同mtDNA区域和基因组DNA扩增产物的琼脂糖凝胶（β2-微球蛋白)在从原始人类T细胞纯化的EV中进行分析。c（c）琼脂糖凝胶电泳显示纯化EV中的DNA检测。用DNase或DNase和Tx-100处理从J77T的培养上清液中获得的EV。通过PCR扩增评估线粒体DNA和基因组DNA水平(HVRII公司和β2-微球蛋白分别为).从经DNase处理或未经DNA酶处理的J77 T细胞中分离出DNA（DNA + DNase和DNA）分别显示为DNase活性的控制。d日线粒体DNA、TSG101和CD63在蔗糖组分中的分布。人Jurkat T细胞的EV放置在不连续的蔗糖梯度上，并通过隔夜离心漂浮。对来自梯度级分的DNA进行PCR扩增HVRII公司mtDNA区域。利用TSG101和CD63免疫印迹分析梯度组分的蛋白质。显示了具有代表性的凝胶(n个 = 3).e（电子）纯化原代小鼠T淋巴细胞外显子，将其偶联到硫酸醛微球上，并在渗透和非渗透条件下用抗DNA抗体染色进行流式细胞术分析。直方图显示外泌体中的DNA染色。数字是代表性实验中阳性群体的平均荧光强度(n个 = 3).（f）左图：直方图显示，在非渗透条件下，外显体中的氧化DNA染色与抗8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）抗体偶联的硫酸醛珠。右图：qPCR分析显示，从外显体和相同外显体产生细胞的线粒体部分获得的DNA中，指示的线粒体基因富集。用8-OHdG和总DNA抗体免疫沉淀两个组分的DNA。图中显示了两个独立实验中重复的外显体中氧化DNA和总DNA相对于其在产生细胞线粒体部分含量的比率。t吨-测试：*P（P）-价值 < 0.05, ***P（P）-价值 < 0.0001
图3
图3
线粒体成分分离成MVB并分泌在外泌体中。一FCCP处理的HEK293细胞共聚焦共定位分析（4 h） SSBP1（红色）、EEA1和CD63（绿色）染色。酒吧，10 微米。图中显示了SSBP1和EEA1或CD63的Mander共同定位系数的平均值(n个 = 3).t吨-测试：***P（P）-价值 < 0.0001.b用Rab7-Q67L-GFP（Rab7mutGFP，绿色）和mitoDsRed（红色）联合转染HEK293细胞的共聚焦共定位分析，并对TFAM（紫色）和细胞核（HOECHST 58，蓝色）进行免疫染色。中央和右侧图像显示左侧图像的高倍放大（上部面板中的Rab7-Q67L-GFP和mitoDsRed；下部面板中的Rab7-Q67 L-GFP与TFAM）。图表：沿相应白线的荧光曲线。酒吧，10 微米。c（c）从等量的shControl和shnSMase2 J77 T细胞获得的外体部分中的线粒体成分。免疫印迹法检测ATAD3、TFAM和CD63；用聚合酶链式反应检测线粒体DNAHVRII公司图：典型实验中外体蛋白和线粒体DNA的量化(n个 = 3).d日流式细胞术分析nSMase2和Rab27a敲除的HEK293细胞的线粒体质量（Mitotracker green）、细胞内ROS水平（DCFDA染色）、氧化DNA（8-OHdG Ab染色）和内源性TFAM。图表：5-8个独立实验的量化（平均值）。t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05**P（P）-价值 < 0.001.e（电子）电子显微镜图像显示shnSMase2和shRab27a HEK293细胞线粒体超微结构和嵴组织缺陷。图表：线粒体嵴宽度的量化（平均值）。t吨-测试：***P（P）-价值 < 0.0001.（f）图：对照组shnSMase2和shRab27a HEK293细胞的基础耗氧率（OCR）。点表示重复或三次运行的三个独立实验的平均值。t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05, ***P（P）-价值 < 0.0001. 图：shControl、shnSMase2和shRab27a HEK293细胞对寡霉素（Oligo）、fccp和鱼藤酮加抗霉素A（Rot/AA）的OCR反应。(n个 = 2; 意思是 ± S.E.M.）。克Jurkat T细胞外显子的Western blot分析：未经处理、血清饥饿过夜或用巴非霉素A处理。对膜进行TFAM、CD81和CD63的印迹。图：外体部分中的纳米颗粒浓度（平均值，两个独立实验）。小时Western blot分析从转染对照或LC3 siRNA的Jurkat T细胞中获得的外显体。图：外显体部分中的纳米粒子浓度（平均值，n个 = 2). 蛋白质印迹是三个独立实验中的代表性实验
图4
图4
免疫同源物相互作用过程中线粒体成分的转移。一流式细胞术分析Raji B细胞与来自J77 T细胞对照或稳定表达有丝分裂DsRed的外显子培养过夜（代表性实验，n个 = 3).bUp:C57线粒体基因组的RFLP分析第57页和C57新西兰银行老鼠。总DNA来自C57第57页T淋巴细胞和C57新西兰银行BMDC。第57页第57页单倍型包括一个BamHI限制位点；酶消化产生两个较小的414片段 pb和250 第页。C57中PCR产物的消化新西兰银行单倍型产生664的单一条带 pb（全长）。C57外源线粒体DNA的Down、RFLP检测新西兰银行DC隔夜孵化，C57的外泌体数量增加第57页CD4细胞+T淋巴细胞。414 pb和250 C57中出现铅碎片氮杂硼添加外泌体后的DC（1/3、2/3和3/3通道）。图：RFLP分析的强度曲线；箭头表示C57 mtDNA单倍型。第57页第57页CD4细胞+lane显示了一条664 pb的带，对应于RFLP分析中PCR产物的未完全消化和图像的高曝光。代表性实验(n个 = 3).c（c）从表达外体蛋白CD63GFP、线粒体靶向的线粒体YFP或mtDNA-结合蛋白TFAM-DsRED的J77 T细胞向未脉冲或SEE脉冲Raji B细胞（CMAC）的外体和线粒体转移。点图，共培养后的细胞数量。红色方框包围获得外体或线粒体荧光标记的Raji B细胞（占Raji细胞总数的百分比）。图：从3到5个独立实验中，Raji B细胞在IS形成时获得荧光的百分比；平均值，t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05, **P（P）-价值 < 0.001, ***P（P）-价值 < 0.0001.d日免疫同源相互作用期间RFLP检测mtDNA转移的工作流程。e（电子）检测外源性C57第57页来自供体OT-II CD4的mtDNA+受体C57中的T细胞新西兰银行抗原刺激后的DC（OVA）。Gels，线粒体基因组的RFLP分析(n个 = 2). 图：RFLP的强度曲线。（f）C57线粒体基因组的RFLP分析第57页和C57新西兰银行老鼠。左凝胶显示C57的RFLP分析第57页T淋巴细胞和C57新西兰银行DC。右凝胶：缺乏外源C57第57页受体C57中供体DC的mtDNA新西兰银行CD4细胞+T细胞。图表：RFLP分析的强度剖面。代表性实验(n个 = 3)
图5
图5
外显子启动树突状细胞的抗病毒天然免疫反应。一上面板：T细胞外显子获取后DC RNAseq分析的工作流程。下面板：四个DC生物复制品的RNAseq热图，有或没有外显体摄取（DC + EXO与DC）。面板显示上调（黄色）或下调（蓝色）基因具有最高的显著折叠变化。bGO注释的生物过程受外显子添加的不同调节；第页-给出了顶级生物过程的值。c（c）获得T细胞外泌体后DC通路上调或下调的灵巧性分析预测。d日野生型树突状细胞抗病毒反应基因的定量实时PCR（qRT-PCR）刺Gt/Gt胞外体加成后的DC。平均值，n个 = 4,t吨-测试***P（P）-价值 < 0.0001和****P（P）-价值 < 0.00001.e（电子）上面板：免疫荧光显微镜图像显示外源体添加后树突状细胞中STING聚集（绿色）。为清晰起见，DC用指骨样蛋白（紫色）染色肌动蛋白，用HOECHST 58（蓝色）染色细胞核。酒吧，10 微米。下图：外泌体添加后STING聚集物大小和数量的量化。平均值，n个 = 26（控制），35（STING），t吨-测试***P（P）-价值 < 0.0001和****P（P）-价值 < 0.00001.（f）野生型树突状细胞抗病毒反应基因的qRT-PCR分析红外线3−/−胞外体加成后的DC。数据(d日,（f）)显示每个基因型四只小鼠的代表性实验的mRNA水平量化：t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05, **P（P）-价值 < 0.001, ***P（P）-价值 < 0.0001，和****P（P）-价值 < 0.00001.克野生型DC中添加未经DNA酶处理或预处理的外源体后抗病毒反应基因的qRT-PCR分析。数据显示了三个独立实验的平均值。t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05
图6
图6
抗原驱动的免疫相互作用引发DC感染病原体。一抗原依赖性接触DC抗病毒反应的qRT-PCR分析。16天后分析分类DC中的基因表达 h共轭物形成。数据显示了五个独立实验的平均值。t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05.b左：流式细胞术分析稳定表达CD63GFP的J77 T细胞与未激发或SEE激发的Raji B细胞共培养后的外体摄取。免疫相互作用后，根据外体摄取水平（CD63GFP含量）对Raji B细胞（CMAC）进行分类。点图显示了分类前和分类后Raji种群中的GFP信号。右：图表显示了对Cxcl10公司在低和高外显体摄取SEE的Raji B细胞群中。平均值；n个 = 三。t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05.c（c）上面板：外泌体介导抗病毒保护分析的时间流。DC孵育4个 h用T细胞外泌体，感染痘苗-GFP，并用流式细胞仪分析感染水平。左下：感染痘苗-GFP的DC的点图，有或没有外体预处理。右下角：不同病毒载量下感染DC的百分比，有或没有外体预处理。平均值；n个 = 4;t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05, **P（P）-价值 < 0.01之间。d日上面板：免疫同源相互作用后外显体介导抗病毒保护分析的时间流。将卸载或OVA肽负载的DC培养4个 含CD4的h+OT-II T细胞感染痘苗-GFP，并通过流式细胞术分析感染水平。左下：在存在或不存在OVA肽的情况下感染痘苗-GFP的DC（CD11c上的门控）的点图。右下：存在或不存在抗原依赖性免疫接触的不同病毒载量的感染DC的百分比。平均值；n个 = 3–6;t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05, **P（P）-价值 < 0.01***P（P）-价值 < 0.0001.e（电子）将卸载或OVA肽负载的DC培养4个 含CD4的h+OT-II T细胞用越来越多的manumycin预处理，感染痘苗-GFP，并用流式细胞仪分析感染水平。图表显示了受感染DC的比例。数据(b,c（c）,d日,e（电子）)是五到七个独立实验的量化平均值：t吨-测试*P（P）-价值 < 0.05, **P（P）-价值 < 0.001，以及***P（P）-价值 < 0.0001
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