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.2018年7月19日；71（2）:319-331.e3。
doi:10.1016/j.molcel.2018.06.004。 Epub 2018年7月5日。

聚（ADP-核糖）聚合酶在DNA复制过程中作为未点燃冈崎片段传感器的重要性

哈娜·汉兹利科娃 1, 伊洛娜·卡拉索娃 2, 安妮·A·德明 三, 刘易斯·彭尼科特 三, 祖扎娜·希拉罗娃 2, 基思·卡尔德科特 4
附属公司

聚（ADP-核糖）聚合酶在DNA复制过程中作为未点燃冈崎片段传感器的重要性

哈娜·汉兹利科娃等。 分子电池. .

摘要

PARP酶在修复随机DNA断裂的过程中合成聚ADP-核糖。然而，令人惊讶的是，我们发现大多数（如果不是全部）内源性多聚物（ADP-核糖）在正常S期细胞的DNA复制位点检测到。这种S相聚（ADP-核糖）不是由受损或错误结合的核苷酸或DNA复制应激引起的。相反，DNA复制蛋白LIG1或FEN1的扰动使S相多聚物（ADP-核糖）增加了10倍以上，这意味着非门控冈崎片段是S相PARP活性的来源。事实上，S相PARP活性是通过用依梅汀抑制冈崎片段的形成来消除的，依梅汀是一种选择性抑制滞后链合成的DNA复制抑制剂。重要的是，DNA复制过程中的PARP激活招募了单链断裂修复蛋白XRCC1，而缺乏PARP活性和/或XRCC1的人类细胞对FEN1扰动非常敏感。总之，我们的数据表明，PARP1是DNA复制过程中未门控冈崎片段的传感器，有助于它们的修复。

关键词：DNA修复；DNA复制；DNA链断裂；PARP1；复制后修复。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
用二甲基亚砜载体或PARG抑制剂（PARGi）孵育30分钟后，在去污剂提取的U2OS细胞中DNA复制位点（A）ADP-核糖和PCNA（指示S期）免疫染色的S期主要检测到内源性多聚体（ADP-核糖）。比例尺，20μm。（B） 野生型ADP-核糖和PCNA免疫染色，第1部分−/−、和第1部分−/−/第2部分−/−用DMSO载体或PARG抑制剂孵育15分钟后的RPE-1细胞。显示了典型的共焦图像。比例尺，5μm。（C） 野生型（WT）中指示蛋白质的Western blotting，第1部分−/−,第2部分−/−,第3部分−/−、和第1部分−/−/第2部分−/−RPE-1细胞系（左）和在PCNA-阴性（非S期）和PCNA-阳性（S期）细胞中与DMSO载体或PARG抑制剂孵育15分钟后这些细胞系中ADP-核糖水平的定量（SEM平均n=4）。典型的ScanR图像如图S1B所示。
图2
图2
在没有或存在PARG抑制剂或MMS的情况下，用10μM EdU孵育20分钟后，RPE-1细胞中的S相聚核糖（ADP-核糖）不是由DNA损伤或复制叉应激（A）引起的。DAPI染色根据EdU阳性（S期）和DNA含量（G1和G2）对细胞周期群进行门控（SEM平均n=3）。（B） 野生型和野生型ADP-核糖的典型ScanR图像和定量XRCC1公司−/−RPE-1细胞如（A）所示（扫描电镜下n=3的平均值）。（C） 野生型和野生型细胞提取物中的AP内切酶蛋白（左下）和活性（左上）APE1接口额外转染APE1 siRNA的基因靶向人类HAP1细胞（表示为APE1接口杜兰特)进一步降低APE1水平和活动。右图：预提取未经处理野生型和APE1接口杜兰特细胞和细胞内用PARG抑制剂或MMS孵育20分钟。比例尺，20μm。角落里的数字是归一化为野生型样本的所有细胞核的平均ADP-核糖强度，在图像J中量化。（D） MMR缺陷患者ADP-核糖的定量(MSH3级和MLH1型突变型）HCT116细胞及其染色体互补的MMR-精通型对应物HCT116+Ch3(MLH1型-补充）和HCT116+Ch3+5(MLH1型-和MSH3型-补充）在含有或不含PARG抑制剂的培养60分钟后。根据PCNA（S期）强度（SEM平均n=3）对细胞群进行门控。典型的免疫荧光图像如图S2B所示。（E） PCNA阴性（非S期）和PCNA阳性（S期）中ADP核糖的定量纳赛赫2b+/+和纳赛赫2b−/−使用或不使用PARG抑制剂孵育60分钟后的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（SEM平均n=3）。典型的ScanR图像如图S2C所示。（F） 如图所示，未经处理的RPE-1细胞和RPE-1电池在加入或不加入羟基脲（HU）孵育2小时后，以及加入或不添加PARG抑制剂孵育最后20分钟后，ADP-核糖和γH2AX免疫染色的典型共聚焦图像。比例尺，20μm。插图，右侧：每张图像中的一个具有代表性的放大单元格。
图3
图3
与二甲基亚砜载体或PARG抑制剂孵育20分钟后，DNA复制蛋白LIG1和FEN1的扰动增加了S相多聚（ADP-核糖）（A）代表性ScanR图像（左侧，仅PCNA-阳性细胞）和1BR和LIG1-缺陷46BR原代成纤维细胞中ADP-核糖（右侧）的定量。为了定量，根据细胞核PCNA强度对PCNA阴性（非S期）和PCNA阳性（S期）细胞进行门控。注意，在S期46BR细胞中显示非常高的ADP-核糖水平所需的y轴刻度的断裂和变化（SEM平均n=3）。（B） 代表性ScanR图像（左，仅PCNA-阳性细胞）和ADP-核糖定量（右），如上野生型，第1部分−/−、和第1部分−/−/第2部分−/−RPE-1细胞系。如图所示，用二甲基亚砜载体或FEN1抑制剂（FEN1i）处理细胞30分钟，最后15分钟内是否添加PARG抑制剂。注意，在FEN1抑制剂/PARG抑制剂处理的RPE-1细胞中显示非常高的ADP-核糖水平所需的y轴刻度的断裂和变化（SEM平均n=3）。另请参见图S5。（C） （B）实验中S期（PCNA-阳性）细胞的典型共焦图像，说明了聚（ADP-核糖）与PCNA在DNA复制位点的定位。比例尺，5μm。
图4
图4
用Emetine抑制冈崎片段形成可防止S期ADP-核糖基化（A）如图所示，在与或不与Emetine（EME）和/或FEN1抑制剂孵育45分钟的野生型RPE-1细胞中，在最后20分钟内添加或不添加PARG抑制剂的情况下，对ADP-核糖和EdU进行间接免疫荧光成像。在最后20分钟内，将EdU添加到所有样品中，以检测DNA合成。比例尺，20μm。（B） 如图所示，预提取U2OS间期细胞经羟基脲处理或不处理2小时或用依米汀处理1小时后的平均ADP-核糖水平的代表性ScanR图像（左）和量化（右）（SEM平均n=3）。如图所示，在最后30分钟内是否添加了PARG抑制剂。注意，ADP-核糖定量是所有间期细胞（不仅仅是S期细胞）的平均水平。（C） U2OS细胞经羟基脲处理或不经羟基尿素处理2小时或依米汀处理1小时的EdU标记。将细胞与10μM EdU一起孵育最后20分钟。比例尺，20μm。
图5
图5
S期PARP活性招募DNA修复蛋白XRCC1并保护细胞免受FEN1抑制剂的影响（A）U2OS细胞在DMSO载体或PARG抑制剂存在下孵育30分钟后XRCC1免疫染色的典型共焦图像。立即固定细胞以检测总XRCC1，或在固定前用Triton X-100预先提取细胞以检测染色质结合的XRCC1。图中显示了两个代表性单元格的放大图像（右）。比例尺，20μm。（B） PCNA阳性（S期）野生型XRCC1和PCNA免疫染色的典型共焦图像，第1部分−/−,第1部分−/−/第2部分−/−、和XRCC1公司−/−如图所示，RPE-1细胞在存在或不存在PARG抑制剂的情况下培养15分钟后（顶部），或在野生型RPE-1电池在存在FEN1抑制剂的条件下培养30分钟后（底部）。比例尺，5μm。（C） 野生型克隆存活，第1部分−/−,第1部分−/−/第2部分−/−、和XRCC1公司−/−RPE-1细胞在FEN1抑制剂的指示浓度下孵育。数据是三个独立实验的平均值±SEM。插图显示了一组独立的实验（n=3），其中上述细胞系，以及，XRCC1公司−/−/第1部分−/−用10μM FEN1抑制剂培养细胞。
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中的注释

  • BRCA缺乏癌症的合成致死机制：不再落后。
    van Wietmarschen N，Nussenzweig A。 van Wietmarschen N等人。 分子细胞。2018年9月20日；71(6):877-878. doi:10.1016/j.molcel.2018.08.045。 分子细胞。2018 采购管理信息：30241603 免费PMC文章。

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